[发明专利]胞嘧啶脱氨酶、包含其的碱基编辑系统及其应用

说明书

本发明提供了一种胞嘧啶脱氨酶、包含其的碱基编辑系统及其应用。所述胞嘧啶脱氨酶包含与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的氨基酸序列。本发明的胞嘧啶脱氨酶及两种衍生的新型胞嘧啶单碱基编辑工具，适用于细胞核基因组编辑及线粒体质体基因组编辑，解决了狭小编辑窗口，转录组脱靶，编辑效率低下，5’‑TC序列偏好性问题，扩大了基因编辑和碱基编辑的工具选择和应用范围。本发明提供的线粒体胞嘧啶碱基编辑器具有尺寸小、无序列偏好性和限制性等特点，使其更适用于基于病毒载体的基因治疗，具有良好的基因治疗前景和产业化前景。

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及一种胞嘧啶脱氨酶、包含其的碱基编辑系统及其应用。

背景技术

可编程核酸酶依赖的基因编辑技术，目前主要有三大类，分别是锌指核酸酶技术(zinc finger nucleases,ZFNs)^[1]、转录激活因子效应核酸酶技术(transcriptionactivator-like effectors nucleases,TALENs)^[2]、成簇的规律性间隔短回文重复序列相关蛋白技术(clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated protein 9，CRISPR/Cas9)^[3]。这三类技术发挥基因编辑作用都是通过靶向基因组特定位点，由核酸酶对靶DNA产生切割，造成靶向DNA双链断裂(double-stranded DNA breaks,DSB)，并诱导细胞通过非同源末端连接(non-homologous endjoining,NHEJ)修复DNA，最终导致碱基的随机插入或缺失(Insertions or Deletions,indels)，产生移码突变；或者在同源DNA模板存在的情况下，通过同源定向修复(homology-directed repair,HDR)来替换切割位点周围的DNA，最终达到基因编辑的目的^[4,5]。

在CRISPR/Cas9技术上发展来的碱基编辑器(base editors,BE)，可以在不造成DSB，也不需要引入模板DNA的前体下，实现精确的点突变。目前开发了两类碱基编辑器：胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editors,CBEs)^[5]，它能实现C-G碱基对向T-A碱基对转换(C-to-G)；腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editors,ABEs)^[6]，它能实现A-T碱基对向G-C碱基对转换(A-to-G)。最早一代的CBE融合了大鼠胞嘧啶脱氨酶和催化失活的dCas9(ratAPOBEC1-XTEN-dCas9)，将编辑窗口内的胞嘧啶C催化成为尿嘧啶(uracil,U)，在后续的DNA修复中U被当做胸腺嘧啶T与腺嘌呤A配对，最终实现C-G碱基对向T-A碱基对的转换。为了进一步提高CBE的编辑效率，在CBE的C端融合尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(UGI)并将dCas9替换为nickase Cas9(nCas9/D10A)，从而产生了BE3编辑器(rat APOBEC1-XTEN-Cas9(D10A)-UGI)^[5]。由于Cas9来源于化脓链球菌(Streptococcus pyogenes,SpCas9)，存在NGG序列的PAM限制性以及sgRNA靶向位点5’端4-8位编辑活性窗口限制。