[发明专利]用于温和检测5-羟甲基胞嘧啶的试剂盒及其检测方法

说明书

本发明涉及一种用于温和检测5hmC的试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包括：封闭反应液、APOBEC脱氨基转化液、吡啶硼烷转化液、连接反应液和扩增反应液；所述连接反应液包括探针A和探针B。本发明首先应用葡糖转移酶将二磷酸尿苷‑葡萄糖（UDP‑Glu）修饰在5hmC的羟基上形成5gmc，保护5hmC不被后续反应影响，之后应用APOBEC对C和5mC进行脱氨基转化为尿嘧啶（U），再通过吡啶硼烷将5fC和5caC转化为二氢尿嘧啶（DHU），U与DHU与A碱基互补配对，而5gmc依然与G配对，从而5hmC与其他碱基形成单碱基差异。采用基于连接的环介导等温扩增（LAMP）高灵敏检测5hmC。本发明的检测方法温和高效，能检测低至2fM的5hmC，特异性达到1%。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于温和检测5-羟甲基胞嘧啶的试剂盒及其检测方法。

背景技术

DNA甲基化作为研究最广泛的表观遗传修饰，具有多种生理和病理功能,对哺乳动物的发育极其重要。随着5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）和TET酶的发现，去甲基化已成为科学研究的焦点。TET家族蛋白可以将5-甲基胞嘧啶（5mC）甲基上的氢氧化为羟基从而形成5hmC，5hmC可以被进一步氧化为5-醛基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC）,在TDG和碱基修复的作用下去除表观修饰。5hmC不仅是主动去甲基化过程的中间体，而且具有自身的特点和功能。大多数5hmC是稳定的DNA修饰，存在高度的组织特异性，在胚胎干细胞和脑组织中富集。值得注意的是，与正常组织相比，在人类癌症中5hmC的水平显著减少，被认为是诊断癌症的一种表观遗传标记物。此外，5hmC不仅在神经发育和疾病中发挥重要作用，而且参与染色质结构的调节和基因表达。在神经退行性疾病中5hmC的含量与健康对照相比有显著差异。但由于方法限制5hmC在癌症和神经退行性疾病中的作用机制和生物功能仍不清楚。鉴于5hmC在表观遗传调控机制和包括癌症在内的多种疾病中早期诊断中的重要意义，急需发展简单、快速、温和地检测方法应用于疾病的早期诊断和深入的机制研究。

高效液相色谱(HPLC)和质谱(MS)法被广泛用于测定胞嘧啶残基中5hmC的全基因组百分比含量。但是这些方法只能检测全基因组DNA中5hmC的总含量，不能提供任何5hmC的序列信息和位点分布。亲和富集或化学标记辅助测序策略可以对基因组DNA中的5hmC进行近似定位，然而，这些富集片段通常包含几百到上千个碱基，不能给出5hmC在DNA片段中的准确位置。由于5mC和5hmC都抗亚硫酸氢盐的脱氨反应，因此经典亚硫酸氢盐的方法无法将两者进行区分。因此在此基础上发展了氧化亚硫酸氢盐测序(oxBS-seq)和tet辅助的亚硫酸氢盐测序(TAB-seq)可以确定每个5hmC位点的位置和相对丰度。然而这些方法中的亚硫酸氢盐处理需要高热和高碱的条件，会造成DNA序列断裂，不适用于少量样品的检测。最近发展了需化学预处理及选择性标记就可以直接区分5hmC、C和5mC的纳米孔技术，无需对目标序列进行扩增就可以实现单分子检测，蛋白质纳米孔测序也被发展为第三代测序技术。但该方法定量分析仍是一个巨大的挑战。这些方法可以在单碱基分辨率下精确定位5hmC的位点，但对于少数有重要生理和病理功能的已知位点的5hmC检测，测序需要极高的深度，测序技术对仪器和数据分析要求高不适合应用于普通实验室和临床研究。因此，简便、快速无亚硫酸氢盐处理地定量分析基因组DNA中已知特定位点的5hmC，对进一步揭示其生物学功能和疾病诊断具有重要意义。

近年来，应用硼酸修饰辅助的PCR法，葡萄糖修饰辅助的连接滚环法和氧化亚硫酸氢盐辅助的连接滚环法都无法实现简单、快速地检测特定位点5hmC。我们也报道了HpaII辅助连接-聚合酶链反应(PCR)，它具有高的灵敏度和特异性，仍需要氧化亚硫酸氢盐处理，且操作复杂，耗时长。在大量C和5mC的背景干扰下如何简单，快速、低损地对特定位点5hmC进行精确定量仍一个巨大的挑战。

鉴于此，申请此专利。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于温和检测5-羟甲基胞嘧啶的试剂盒及其检测方法，本发明的检测方法温和高效，能检测低至200aM的5hmC，特异性达到1%。