[发明专利]用于温和检测5-羟甲基胞嘧啶的试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种用于检测5hmC的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：封闭反应液、APOBEC脱氨基转化液、吡啶硼烷转化液、连接反应液和扩增反应液；所述连接反应液包括探针A、探针B；所述探针A的序列如SEQ ID NO:1所示；所述探针B的序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中封闭反应液包括10×cutsmart 缓冲液1μL，50×UDP-Glu 1μL，以及10U 噬菌体β-葡萄糖基转移酶(T4-βGT) 1μL，去离子水2μL，总体积5μL。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述APOBEC脱氨基转化液包括APOBEC脱氨酶0.2μL，10×APOBEC脱氨基缓冲液1μL，牛血清白蛋白0.1μL，总体积1.3μL。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述吡啶硼烷转化液包括600mM的pH=4.3的醋酸钠溶液1μL和1M吡啶硼烷0.1μL，总体积1.1μL。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述连接反应液包括20nM的探针A 1μL，20nM的探针B 1μL，5U的Amp连接酶0.2μL，10×Amp连接酶缓冲溶液1μL和去离子水5.8μL，总体积9μL。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括LAMP反应混液包括10mM上游引物0.5μL，10mM 下游引物0.5μL，2.5mM的dNTP 0.8μL，8U的Bst DNA聚合酶0.5μL，10×ThermoPol反应缓冲溶液1μL，5M的甜菜碱2μL，50×SYBR Green I 0.2μL和去离子水2.5μL，总体积8μL。

7.一种采用权利要求1-6任一所述的试剂盒定量检测基因组中5hmC的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）封闭5hmC：准备封闭反应溶液和待测DNA样品，将5μL封闭反应溶液与2μL待测DNA样品在200μL PCR管中混合，进行封闭反应；

（2）脱氨转化：步骤（1）封闭反应结束后，将PCR管快速转移到 PCR 管架上冷却；将1.3μL的APOBEC脱氨基转化液加入到封闭反应体系，进行脱氨反应；

（3）吡啶硼烷转化：将1.1μL的吡啶硼烷转化液加入到步骤（2）脱氨转化后的反应溶液中，放入恒温混匀仪中进行反应，反应结束后应用UNlQ-10柱式通用DNA纯化试剂盒对DNA纯化；

（4）连接反应：将步骤（3）纯化后的DNA样品加入到连接反应混液中，加热使dsDNA变性，在合适的温度下以目标序列为模板在连接酶的催化下连接探针A和探针B；

（5）LAMP扩增反应：将步骤（4）的连接产物取2μL加到8μL LAMP反应混液中；LAMP反应的混液混匀后立即转到StepOne Real-Time PCR系统进行恒温反应，实时荧光强度间隔1分钟检测一次。

8.根据权利要求7所述的定量检测基因组中5hmC的方法，其特征在于，步骤（1）中，反应条件为：在37℃下孵育2小时；步骤（2）中，反应条件为：在2小时内将温度从4℃梯度升温到50℃进行孵育，50℃持续10分钟；步骤（3）中，反应条件为：恒温混匀仪设置转速850 rpm，37℃孵育16小时；步骤（4）中，反应条件为：在90 ℃加热3分钟，使dsDNA高温变性，之后在45℃反应15分钟；步骤（5）中，反应条件为：58℃反应100分钟。