[发明专利]一种用于细胞膜蛋白质标记的组合物及其应用

说明书

本发明公开了一种用于细胞膜蛋白质标记的组合物及其应用，属于蛋白质分析技术领域。基于原核表达APEX2蛋白酶的APEX邻近标记技术，在原核细胞中表达并纯化APEX2蛋白酶，与BP分子共孵育人胚肾细胞(HEK293T)，在过氧化氢存在下标记细胞膜表面蛋白质，建立细胞膜表面蛋白质的APEX邻近标记实验体系，并获得BP修饰的膜蛋白质。经质谱检测和数据处理，与不加过氧化氢的对照组相比，2945个蛋白质中的992个显著上调，其中765个为膜相关蛋白质，表明基于体外纯化的APEX2蛋白酶的APEX邻近标记技术能够特异性的获得细胞膜表面蛋白质。

技术领域

本发明属于蛋白质分析技术领域，具体涉及用于细胞膜蛋白质标记的组合物及其应用。

背景技术

蛋白质作为生命物质的基础，其功能的多样性、复杂性使蛋白质组学成为重要研究领域。蛋白质相互作用涉及生命活动的各个过程，是细胞信号转导、物质代谢、周期调控、细胞增殖分化和凋亡等一切生命活动的基础，对蛋白质相互作用的研究获得蛋白质连锁图，为疾病机制、治疗、预防和药物研发提供理论基础，为生命规律研究提供新的线索。

邻近标记技术是将一个具有催化功能的蛋白酶与诱饵蛋白质融合，蛋白酶通过催化活性生物素共价结合到诱饵蛋白质周围的蛋白质上，实现对诱饵邻近蛋白质的生物素化标记，经由链霉亲和素对生物素化蛋白的富集和质谱检测，最终鉴定诱饵蛋白的邻近蛋白。APEX邻近标记技术利用APEX2蛋白酶在过氧化氢存在下的催化活性，使生物素苯酚(BP)与周围蛋白质共价结合，实现细胞原位水平蛋白质的标记，具有较高的催化效率，提高了鉴定邻近蛋白质的时间分辨率。与传统亲和纯化或免疫共沉淀等蛋白质相互作用鉴定手段相比，该技术能够得到蛋白质复合体及亲和力低或瞬时的蛋白质相互作用，为获得动态蛋白质相互作用提供了可能。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：如何实现APEX邻近标记技术对细胞膜蛋白的标记。

为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供用于细胞膜蛋白标记的组合物，所述组合物可包括：APEX2蛋白酶、过氧化氢和下述两种物质中的至少一种物质：生物素苯酚(BP)和生物素苯酚类似物。

进一步地，上述的组合物中，所述APEX2蛋白酶可选自下述任一项：

A1)、氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

A2)、氨基酸序列是SEQ ID No.1的第37-285位的蛋白质；

A3)、在A1)或A2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合标签蛋白得到的具有与A1)或A2)相同活性的融合蛋白。

其中，SEQ ID No.1由285个氨基酸残基组成。

上述APEX2蛋白酶可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag蛋白标签、His蛋白标签、MBP蛋白标签、HA蛋白标签、myc蛋白标签、GST蛋白标签和/或SUMO蛋白标签等。

进一步地，上述的组合物中，所述APEX2蛋白酶按照包括如下步骤的方法制备：使所述APEX2蛋白酶的编码基因在生物细胞中进行表达得到所述APEX2蛋白酶。

进一步地，上述的组合物中，所述生物细胞可为微生物细胞。

进一步地，所述APEX2蛋白酶的制备方法中，所述APEX2蛋白酶的编码基因的编码序列(CDS)是SEQ ID No.2第5179-5925位所示的DNA分子。