[发明专利]一种高产纳米硒酵母的培育方法

说明书

本发明公开了一种高产纳米硒酵母的培育方法，具体为：制备活化种子液；采用等离子和紫外诱变，筛选高产纳米硒菌株；对诱变菌株进行传代培养；将传代培养后的菌株种子液接种到发酵培养基中，添加亚硒酸钠溶液发酵培养；收集发酵液，离心、洗涤，烘干粉碎，得干硒酵母粉；将干硒酵母粉配制成硒酵母水溶液，将硒酵母水溶液与破壁酶溶液混合后孵育，加入萃取剂，收集中间水相，离心、洗涤，收集沉淀，即为纳米硒酵母。本发明采用等离子诱变和紫外诱变，通过改变微生物的结构，从而产生基因突变，筛选出高耐硒的突变菌株。不仅提高了亚硒酸钠的转化效率，而且在酵母细胞内形成的纳米硒外层包裹着一层蛋白膜，是一种无毒性、可重复的绿色生产方法。

技术领域

本发明属于微生物育种技术领域，涉及纳米硒制备及发酵工艺优化，具体涉及一种高产纳米硒酵母的培育方法。

背景技术

硒被证实是人类和动物生长发育过程中较为重要的微量元素，具有抗氧化特性，可以防止病毒表达，增强免疫力。伴随着纳米硒的迅速发展和广泛应用，其生物安全性，特别是在饲料添加剂、生物医学和治疗领域的应用受到了人们极大的关注。纳米硒外围存在蛋白晕圈，不仅可以减少纳米硒的毒性，而且具有较高的生物安全性，在实际应用中具有很大的发展潜力。

目前，利用微生物法合成纳米硒被认为是安全性较高的方法。细菌和真菌在遭受毒性过大的无机硒时，容易发生细胞反应，通过生理代谢途径将有毒的无机硒转化为毒性较小的纳米硒。对于酵母菌，特别是酿酒酵母，作为一种重要的益生菌和食品添加剂，是将无机硒转化为纳米硒的理性微生物。由于利用酿酒酵母合成的含有蛋白晕圈的纳米硒，其结构具有一定的复杂性，因此有必要将纳米硒和蛋白晕圈分离并分析其特性，与此相关的报道未见，因此其具有潜在的研究价值。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种高产纳米硒酵母的培育方法，本发明利用酿酒酵母作为种子液发酵菌，筛选出一株高产纳米硒的突变菌，选择最优的亚硒酸钠添加量及亚硒酸钠添加时间，制备得到的纳米硒稳定性较好、转化率高。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种高产纳米硒酵母的培育方法，包括以下步骤：

（1）制备活化种子液；

（2）采用等离子和紫外诱变，筛选高产纳米硒菌株；

（3）对诱变菌株进行传代培养，确定其遗传稳定性；

（4）将传代培养后的菌株种子液接种到发酵培养基中发酵培养，在发酵培养过程中添加亚硒酸钠溶液发酵培养；

（5）收集发酵液，离心、洗涤，烘干粉碎，得干硒酵母粉；

（6）将步骤（5）得到的干硒酵母粉配制成硒酵母水溶液，将硒酵母水溶液与破壁酶溶液混合后孵育，加入萃取剂，收集中间水相，离心、洗涤，收集沉淀，即为纳米硒酵母。

本发明的进一步改进方案为：

步骤（1）种子液为酿酒酵母种子液，制备活化种子液的具体过程为：-80℃取出酿酒酵母，接种于YPD固体培养基中进行平板划线，然后置于30℃恒温培养箱培养2天，挑取长势较好单菌落于50/250 mL YPD液体培养基中培养，培养条件为30-40℃，250-400 rpm培养24-35h。

进一步的，所述YPD固体培养基为：Tryptone 10-30 g/L，Yeast 5-15 g/L，Glucose 25-40 g/L，Agar Powder 15-30g/L；所述YPD液体培养基为：Tryptone 10-30 g/L，Yeast 5-15 g/L，Glucose 25-40 g/L。

进一步的，步骤（2）诱变时间10-70s，紫外时间10s，平台高度20mm，气体流量12slm。

优选的，步骤（2）诱变时间为50s。