[发明专利]人工模拟cfDNA标准品及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种人工模拟cfDNA标准品及其制备方法与应用。该制备方法包括以下步骤：将背景细胞系的gDNA和突变细胞系的gDNA混合，制得混合gDNA；采用缺刻酶切的方式将混合gDNA打断，制得cfDNA标准品；其中，背景细胞系为未发生突变的细胞系，突变细胞系为在预设位点发生突变的细胞系。通过采用缺刻酶切的方式对混合gDNA进行打断，能有效避免文库转化效率低和双链占比低的问题，同时还能避免纯合突变的引入造成最低检测线难以确定的情况。该制备方法简单，能工业化大量生产，能很好地模拟真实的cfDNA样品，作为阳性参考品高效地应用于高通量测序等项目，提供高精度的检测结果。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种人工模拟cfDNA标准品及其制备方法与应用。

背景技术

高通量测序技术(High-throughput sequencing)又称“下一代”测序技术 (Next-generationsequencing technology,NGS)，是一种能够一次并行对大量核酸分子进行平行序列测定的技术，已成为当前医学诊断中获取及时准确的诊断信息的重要来源。在建立检测方法时，需要对检测方法的科学性和准确性进行评估，以提升诊断信息的精准度，对检测方法的评估过程以及检测过程本身都需要采用标准样品作为对照进行参考。

尽管组织样本仍是进行高通量测序技术等基因检测的第一选择，但有时候由于条件所限，例如取样量偏少，或病人体质不宜活检等情况下，只能采用血液作为备选进行基因检测。cfDNA(cell-free DNA)是指细胞凋亡后进入血液中裂解释放出来的DNA，是一种未被包裹的、游离的DNA，对cfDNA的检测可以提供有效的医疗诊断信息。例如，ctDNA(circluting-tumor DNA)，即由肿瘤细胞释放到血液中的DNA，属于cfDNA中的一种，血浆中ctDNA的浓度和可检测到的ctDNA水平已被证明与肿瘤分期有关。然而，传统技术制得的人工模拟cfDNA标准品往往难以模拟真实样品，存在建库效率低、双链形成率低、难以确定最低检测下限等问题，难以适应当前市场对于高效率、高精度的检测需求。

发明内容

基于此，有必要提供一种人工模拟cfDNA标准品及其制备方法与应用，该制备方法操作简单，制得的标准品能真实模拟人体样品，与真实的cfDNA具有相近的建库效率、双链形成率和突变水平，从而有效提升了将其应用于高通量测序技术等重要检测项目的效率和精度。

本发明的第一方面，提供了一种人工模拟cfDNA标准品的制备方法，其包括以下步骤：

将背景细胞系的gDNA和突变细胞系的gDNA混合，制得混合gDNA；

采用缺刻酶切的方式将所述混合gDNA打断，制得所述cfDNA标准品；

其中，所述背景细胞系为未发生突变的细胞系，所述突变细胞系为在预设位点发生突变的细胞系。

在一些实施方式中，所述缺刻酶切的方式是指：采用核酶使所述混合gDNA 随机产生缺口，然后采用缺刻切割酶把所述缺口切断。

在一些实施方式中，

所述制备方法满足以下(1)～(2)中的一个或多个条件：

(1)所述核酶包括创伤弧菌核酸酶、脱氧核糖核酸酶I、Nt.CviPII切刻内切酶以及Nb.Bsm I切刻内切酶中的一种或多种；

(2)所述缺刻切割酶包括T7核酸内切酶。

在一些实施方式中，所述背景细胞系的gDNA与突变细胞系的gDNA混合的摩尔比为(90～99.99)：(0.01～10)。

在一些实施方式中，采用缺刻酶切的方式将所述混合gDNA打断后，所得片段的主峰大小为150bp～500bp。