[发明专利]一种快速鉴定布鲁菌的方法及其使用的引物组组合

说明书

本发明公开了一种快速鉴定布鲁菌的方法及其使用的引物组组合。本发明通过对布鲁菌的核心基因组序列进行分析，从而获得了5个布鲁菌12个种间的高度保守特异序列(即布鲁菌的特异序列标签)，之后依据5个布鲁菌的特异序列标签的核苷酸序列设计并合成五个引物组。每个引物组可以完全覆盖布鲁菌现有的12个种的鉴定。目前，国内外尚无利用本发明提供的布鲁菌的特异序列标签特异性鉴定布鲁菌的荧光定量PCR方法，本发明提供的方法可以简单、快速、灵敏、特异的检测布鲁菌，避免漏检，为布病疫情的早期预警及其防控提供有力支撑。本发明具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速鉴定布鲁菌的方法及其使用的引物组组合。

背景技术

布鲁菌病(Brucellosis，简称“布病”)是一种由布鲁菌引起的人畜共患传染病。布鲁菌为革兰阴性杆菌。根据不同的宿主偏好、表型、致病性以及病原学特征，布鲁菌一般可分为6个经典种19个生物型，分别为B.melitensis(羊)、B.abortus(牛)、B.suis(猪)、B.canis(犬)、B.neotomae(沙林鼠)和B.ovis(绵羊)；6个新发现的种，分别为B.microti(田鼠)、B.pinnipedialis(鳍足类)、B.ceti(鲸类)、B.inopinata(从人类天然宿主中分离出来)、B.papionis(狒狒)和B.vulpis(狐狸)。布鲁菌不同种、型之间亲缘性很近。早在1968年，国外学者就对公认的6种布鲁菌进行了测序鉴定，结果表明，布鲁菌各菌种之间高度同源，基因组一致性达90％以上，各菌种之间基因组差异较小。目前，已有多种检测布鲁菌的方法，如细菌培养分离法、血清学诊断法以及免疫学方法，但上述方法均存在诸多不足。

随着测序技术的快速发展，测序成本不断下降、测序速度和准确性不断提高，这使得布鲁菌群体基因组学的应用日益增多。尽管如此，由于布鲁菌与其他物种之间的高度相似性，使得检测工作存在诸多问题。因此，需要更可靠、更准确的靶标来帮助研究人员快速识别布鲁菌，并将其与相关物种区分开。

随着分子生物学技术的发展，荧光定量PCR检测技术已逐渐成为诊断布病的重要工具。但现阶段，研究者们针对布鲁菌所建立的荧光定量PCR方法存在特异性问题，如引物探针与其他菌属存在交叉。因此，筛选布鲁菌高特异序列，并针对筛选的序列设计一种高灵敏度、特异性的引物探针通过荧光定量PCR方法对布鲁菌进行鉴定，可以更好地加强布病病原监测能力，为布病的防治提供强有力的技术支撑。

发明内容

本发明的目的是简单、快速、灵敏、特异性的检测布鲁菌，避免漏检。

本发明首先保护一种引物组组合，可包括引物组BRU-1、引物组BRU-2、引物组BRU-3、引物组BRU-4和/或引物组BRU-5；

引物组BRU-1可由引物对BRU-1和探针BRU-1-P组成。引物对BRU-1可由引物BRU-1-F和引物BRU-1-R组成。探针BRU-1-P的一个末端具有荧光标记，另一端具有荧光猝灭基团。引物BRU-1-F的核苷酸序列可如SEQ ID NO:1所示。引物BRU-1-R的核苷酸序列可如SEQ IDNO:2所示。探针BRU-1-P的核苷酸序列可如SEQ ID NO:3所示。

引物组BRU-2可由引物对BRU-2和探针BRU-2-P组成。引物对BRU-2可由引物BRU-2-F和引物BRU-2-R组成。探针BRU-2-P的一个末端具有荧光标记，另一端具有荧光猝灭基团。引物BRU-2-F的核苷酸序列可如SEQ ID NO:4所示。引物BRU-2-R的核苷酸序列可如SEQ IDNO:5所示。探针BRU-2-P的核苷酸序列可如SEQ ID NO:6所示；