[发明专利]一种构建高效生物合成维生素K2

说明书

本发明涉及遗传工程技术领域，具体涉及一种构建高效生物合成维生素Ksubgt;2/subgt;工程菌的方法，包括如下步骤：步骤一、构建得到△pbuE菌株EC1；步骤二、以菌株EC1全基因组为模板，用Psubgt;degQ/subgt;启动子序列替换枯草芽孢杆菌法呢基二磷酸合酶基因ispA的原始启动子，得到菌株EC2；步骤三、以菌株EC2全基因组为模板，敲除1‑脱氧木酮糖‑5‑磷酸合酶基因dxs，得到菌株EC3；步骤四、以克雷伯氏菌全基因组为模板，扩增得到dxs基因，通过与pHY‑Psubgt;43/subgt;载体连接转化至菌株EC3中，得到EC4。本发明通过启动子替换和关键基因优选构建高产MK‑7的枯草芽孢杆菌，最终菌株EC4的MK‑7产量较原始菌株提高了5.42倍。

技术领域

本发明涉及遗传工程技术领域，尤其涉及一种构建高效生物合成维生素K₂工程菌的方法。

背景技术

维生素K₂是一类脂溶性维生素，为甲萘醌类系列化合物，其结构由2-甲基-1,4-萘醌母核和不同长度的异戊二烯侧链构成。根据其分子结构上C-3位异戊二烯侧链数量的不同可分为不同的异构体。其中，含有七个异戊二烯侧链的甲萘醌-7(MK-7)是维生素K₂活力最高的结构形式。

目前维生素K₂主要以化学合成为主，但传统化学合成法存在化学原料来源限制、化学反应产生大量异构体、副产物多、产率低、带来环境污染等问题，且合成的维生素K₂中异戊二烯侧链多为顺式结构，活性低。因此，工业上采用微生物发酵生产维生素K₂备受青睐。它的最大优点是：能够大大简化生产工序并改善劳动条件、减少环境污染、同时也有利于资源开发和综合利用。然而现有菌株发酵生产维生素K₂的产量相对较低，发酵水平相对较低，从而导致成本过高价格昂贵，难以为普通老百姓所能接受。因此，高效选育优良菌株，对于提高发酵生产维生素K₂的生产性能，对于预防和治疗骨质疏松症、心血管疾病和动脉钙化等疾病具有重要的理论和应用价值。

枯草芽孢杆菌是FDA认可的40种可食用益生菌之一。由于其生长速度快，甲萘醌含量高并已通过安全性认证，被认为是工业化生产甲萘醌最具潜力的菌株。合成生物学采用传统生物学获得的知识与材料为基础，利用系统生物学手段对代谢生成物进行定量解析，在工程学以及计算机辅助指导下设计新的生物系统或深度改造原有生物系统，构建微生物细胞工厂重构生化合成网络或组装人工代谢途径，可实现重要化学品如青蒿素、鸦片等的生物合成。维生素K₂在枯草芽孢杆菌中的合成因涉及4个代谢模块约38步的酶催化反应，并且存在有毒中间物及竞争和抑制性代谢途径，采用合成生物学方法优选代谢关键酶及调节关键酶适宜活性，是极具挑战但同时又颇有开创性的工作。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种构建高效生物合成维生素K₂工程菌的方法，以解决现有生物学方法因存在有毒中间物及竞争和抑制性代谢途径而导致维生素K₂产量不高的问题。

基于上述目的，本发明提供了一种构建高效生物合成维生素K₂工程菌的方法，包括如下步骤：

步骤一、以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，敲除嘌呤转运蛋白基因pbuE，构建得到△pbuE菌株EC1；

步骤二、以菌株EC1全基因组为模板，用P_degQ启动子序列替换枯草芽孢杆菌法呢基二磷酸合酶基因ispA的原始启动子，得到菌株EC2；

步骤三、以菌株EC2全基因组为模板，敲除1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs，得到菌株EC3；

步骤四、以克雷伯氏菌全基因组为模板，扩增得到dxs基因，通过与pHY-P₄₃载体连接转化至菌株EC3中，得到用于生物合成维生素K₂菌株的EC4。