[发明专利]一种构建高效生物合成维生素K2

权利要求书

1.一种构建高效生物合成维生素K₂工程菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，敲除嘌呤转运蛋白基因pbuE，构建得到△pbuE菌株EC1；

步骤二、以菌株EC1全基因组为模板，用P_degQ启动子序列替换枯草芽孢杆菌法呢基二磷酸合酶基因ispA的原始启动子，得到菌株EC2；

步骤三、以菌株EC2全基因组为模板，敲除1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs，得到菌株EC3；

步骤四、以克雷伯氏菌全基因组为模板，扩增得到dxs基因，通过与pHY-P₄₃载体连接转化至菌株EC3中，得到用于生物合成维生素K₂菌株的EC4。

2.根据权利要求1所述构建高效生物合成维生素K₂工程菌的方法，其特征在于，所述步骤一中构建得到△pbuE菌株EC1的方法包括如下步骤：

A1、以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，采用如SEQ ID NO.1-3所示的引物组扩增得到左同源臂、右同源臂序列和中间片段；

A2、将获得的左同源臂、右同源臂序列和中间片段进行重叠延伸PCR，得到融合基因片段；

A3、扩增产物纯化后，融合基因片段电转到菌株枯草芽孢杆菌168感受态细胞中，即得菌株EC1。

3.根据权利要求1所述构建高效生物合成维生素K₂工程菌的方法，其特征在于，所述步骤二中得到菌株EC2的方法包括如下步骤：

B1、以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，利用如SEQ ID NO.7-8所示的引物扩增得到ispA1原始启动子的左同源臂、P_degQ序列和右同源臂序列；

B2、以质粒p7C6为模板，利用如SEQ ID NO.25-26所示的引物扩增得到氯霉素抗性基因Cm^R序列；

B3、将B1获得的序列与B2获得的氯霉素抗性基因Cm^R序列行重叠延伸PCR，得到的融合基因片段经扩增产物纯化后，融合基因片段电转到EC1菌株的感受态细胞中，得到菌株EC2、EC21和EC22。

4.根据权利要求1所述构建高效生物合成维生素K₂工程菌的方法，其特征在于，所述步骤三中得到菌株EC3的方法包括如下步骤：

C1、以菌株EC2全基因组为模板，采用如SEQ ID NO.27-28所示的引物扩增得到左右同源臂序列和中间片段；

C2、将获得的左同源臂、右同源臂序列和中间片段进行重叠延伸PCR，得到融合基因片段；

C3、扩增产物纯化后，融合基因片段电转到菌株EC2的感受态细胞中，即得菌株EC3。

5.根据权利要求1所述构建高效生物合成维生素K₂工程菌的方法，其特征在于，所述步骤四中得到菌株EC4的方法包括如下步骤：

D1、将克雷伯氏菌培养至指数生长中期，提取全基因组DNA；

D2、以克雷伯氏菌全基因组为模板，采用如SEQ ID NO.33-34所示的引物扩增得到dxs基因片段；

D3、扩增产物纯化后，构建重组质粒pHY-P₄₃-dxs1转化至菌株EC3中，得到菌株的EC4。

6.根据权利要求5所述构建高效生物合成维生素K₂工程菌的方法，其特征在于，所述构建重组质粒pHY-P₄₃-dxs1的方法是用XbaI和BglII对扩增产物和载体pHY-P₄₃进行双酶切，两者的回收产物，用T4连接酶连接后得到。

7.根据权利要求1所述构建高效生物合成维生素K₂工程菌的方法，其特征在于，所述扩增条件为：98℃变性3min；然后98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸20s，总共34个循环；最后72℃延伸5min。