[发明专利]碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸检测的引物组、试剂盒与方法

说明书

本发明公开了碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸检测的引物组、试剂盒与方法，引物组包括用于检测碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸的引物对与探针，分别如SEQ IDNO.1‑SEQ ID NO.27所示。本发明的检测方法直接从直肠拭子样本中检测碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸，无需核酸提取步骤，具有耗时短、操作简便、覆盖率广、特异性好、防污染等优点。

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，具体涉及碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸检测的引物组、试剂盒与方法。

背景技术

碳青霉烯耐药的肠杆菌科细菌(Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE)为肠杆菌科细菌对多利培南、厄他培南、美罗培南或亚胺培南不敏感，或者证实肠杆菌科细菌产生碳青霉烯酶。其中肠杆菌科包括62个属，常见引起人类感染的有10个属，是重要的临床感染病原菌。碳青霉烯类抗生素具有抗菌谱广、抗菌活性强并对β-内酰胺酶稳定以及毒性低等特点。随着其广泛应用，耐药快速增长，其中CRE由于高度耐药、传播速度快、致死率高而备受关注。

大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌是重要的条件致病菌，在免疫力低下的患者中可引起严重甚至致死性的感染。碳青霉烯类抗菌药物作为目前临床上用于细菌感染强有力的一类抗菌药物，抗菌作用非常强，并且抗菌谱也广，包括亚胺培南、美罗培南、厄他培南等。

但是随着碳青霉烯类抗菌药物的大量使用，产生了碳青霉烯类抗菌药物不敏感的情况，甚至产生了耐药细菌，这极大地限制了碳青霉烯类抗菌药物的使用，产生这一现象的重要原因是菌株获得了碳青霉烯酶基因。其中由质粒携带的碳青霉烯酶基因由于其耐药基因环境存在介导转移的基因元件，使得其易于在不同细菌间转移，造成了碳青霉烯酶耐药性的广泛传播，成为近年临床微生物学领域备受关注的热点之一。碳青霉烯类抗生素耐药菌的出现和流行，给临床抗感染治疗和医院内感染控制带来了极大困难。基于PCR分子诊断技术对临床样本进行耐药基因的检测，为感染防控措施的制定提供科学依据，为临床感染性疾病的诊治争取宝贵时间。

目前现行的病毒诊断方法：

Kirby-Bauer法初筛试验：不同的碳青霉烯类抗生素、不同的细菌、不同的耐药机制，K-B法的选择用药不同，如法罗培南目前被认为是检测产KPC酶菌株最好的指示药物，FDA推荐厄他培南、亚胺培南、美罗培南均可用于肠杆菌科的碳青霉烯类耐药的筛选，而亚胺培南扩展到对碳青霉烯类耐药的不动杆菌属和铜绿假单胞菌的筛选，美罗培南再扩展到对碳青霉烯类耐药的嗜水气单胞菌、蜂房哈弗尼亚菌、多杀巴斯德菌、沙门菌属和志贺菌属的筛选。

纸片筛选及协同试验：(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)2017年推荐的改良碳青霉烯类灭活试验(Carbapenem inactivation method，CIM)简便易行，CIM可以检测出肠杆菌科的多种耐药基因包括KPC、NDM、VIM、IMP、OXA-48和OXA-23，根据基因的不同，与PCR方法检测的结果符合率达83％～100％。

纸片协同试验为简单、价廉且可靠的检测和鉴别CRE表型的检测方法，可在7h内快速鉴定KPC、金属酶和OXA-48型碳青霉烯酶，对指导临床救治和感染控制及流行病学监测意义重大。

Hodge试验：CLSI5于2015年推荐改良Hodge试验(Modified Hodge test,MHT)筛查CRE，仅适用于肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶的筛查。MHT检测CRE的敏感性和特异性分别为89.65％和96.77％。但对金属酶的检测敏感性较差，假阳性和假阴性的存在是此方法的弊端。

显色培养基：科玛嘉显色培养基筛选KPC，内含有抑制革兰氏阳性菌和CSE的成分，作者比较科玛嘉KPC筛选用麦康凯琼脂培养(贴碳青霉烯类纸片)和PCR方法检测KPC基因，敏感性和特异性分别达到92.7％和95.9％，而PCR方法为100％和98.4％。