[发明专利]天冬氨酸酶突变体及其在R-3-氨基丁酸合成中的应用

说明书

本发明提供了天冬氨酸酶突变体及其生产R‑3‑氨基丁酸的方法，属于酶工程领域。所述突变体的氨基酸序列由SEQ ID NO.3所示序列经过一次或多次突变得来。包含其第237位（T237C）、31位（I31V）、88位（K88N）、123位（G123S）四个突变位点中一个或多个突变位点。本发明的天冬氨酸酶突变体具有高催化性和高选择性的优点，经发酵所获得的菌体能够催化300g/L底物，是目前报道的最高的底物浓度。将其用于合成R‑3‑氨基丁酸，可实现7h R‑3‑氨基丁酸生成率和手性纯度最高达99%以上。较之前化学合成法和生物酶法，不但工艺简单，转化率高，而且生产成本也相对较低，具有良好的工业应用前景。

技术领域

本发明涉及酶工程领域，具体涉及一种天冬氨酸酶突变体及利用其合成R-3-氨基丁酸的应用。

背景技术

R-3-氨基丁酸(R-3-aminobutyricacid)，CAS：3775-73-3，是一种典型的手性β氨基酸，作为医药中间体R-3-氨基丁醇的前体物，它可经过一步还原反应生成R-3-氨基丁醇且不改变R-3-氨基丁醇的手型。R-3-氨基丁醇(R-3-amino-1-butanol)，CAS：61477-40-5，是一种用于治疗艾滋病药物度鲁特韦(Dolutegravir)的关键中间体。因此，R-3-氨基丁酸的合成对制备高纯度的度鲁特韦具有重要意义。

目前，传统生产R-3-氨基丁酸的方法主要是化学合成法，但该法不但反应过程复杂，条件苛刻，操作困难，而且生产成本昂贵，重金属污染严重，不利于大规模产业化实施。2007年，Stephen G.Davies等人用化学合成法制备R-3-氨基丁酸，以甲醛为原料，经Horner-Wadsworth-Emmons反应得到2-丁烯酸叔丁酯，再经加成催化加氢，得到R-3-氨基丁酸叔丁酯，最后再经水解得到R-3-氨基丁酸。尽管该合成法产率达到93％，纯度在99％以上，但需要的条件极为苛刻，需在-78℃下进行，操作非常困难。CN104370755公开了另一种制备R-3-氨基丁酸的化学合成法，是以乙酰乙酸乙酯为原料，与乙酰胺缩合，经不对称氢化，再经水解得到R-3-氨基丁酸。该法成本高，污染严重，不利于生产。

近些年，使用生物酶法催化生产R-3-氨基丁酸成为了人们比较倾向的一种趋势。以天冬氨酸酶作为生物酶催化剂为例，该法存在反应时间长，产物转化率低，反应原料浪费的缺陷，往往不利于大规模产业化生产。2014年Andreas Vogel等人通过来源于芽孢杆菌的天冬氨酸酶突变体催化丁烯酸生成R-3-氨基丁酸。该法尽管工艺简单，但催化底物浓度为300mM时，需反应100h才达到60％的转化率。底物浓度低，反应时间长以及转化率低使得该法不适合生产。CN109576317A公开了另一种使用天冬氨酸酶催化生产R-3-氨基丁酸的方法，合成体系中除了使用天冬氨酸酶酶外，还增加了HEPES缓冲液以及铵盐，其转化率虽达到了98％，但需要24h，同样存在反应时间长的缺陷。

因此，亟需开发一种更加高效环保的R-3-氨基丁酸合成路线。

发明内容

为改善现有技术的上述缺陷，本发明的主要目的就是提供一种新的生物酶法生产R-3-氨基丁酸的方法。本发明在传统化学合成法与生物酶法的基础上，经过分子改造，设计出一种天冬氨酸酶突变体，将该酶用于合成R-3-氨基丁酸，较先前化学合成法与生物酶法反应时间更短，成本更低，能够用于工业化大批量生产R-3-氨基丁酸。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

(一)天冬氨酸酶的选择与进化筛选

本发明提供了一种天冬氨酸酶突变体，其为下列任一突变体：

突变体4，所述突变体4是在氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的野生型天冬氨酸酶基础上，将第237位的Thr突变为Cys得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；