[发明专利]一种金属多酚改性的金银纳米粒子制备方法

权利要求书

1.一种金属多酚改性的金银纳米粒子制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

Step1、将2-6 v/v% HAuCl₄ (10 mM)滴加到1-4 v/v% 原花青素(5mM)和ddH2O的混合溶液中，加热下持续搅拌20分钟，得到紫红色的Au种子溶液；采用Au种子、HAuCl4水溶液、AgNO3溶液以及对苯二酚和聚乙烯吡咯烷酮在室温下制备支链AuAg NPs；

Step2、将1 mL AuAg NP分散液与50-150 μL 原花青素溶液(5 mM)旋涡混合10 s，加入15-45 μL FeCl3溶液(25 mM)搅拌10 s；随后，NaOH逐级添加以提高悬浮液的pH值至7.8；得到的mpn涂层的AuAg NPs被离心(6000 rpm, 5分钟)以收集沉淀物；最终的产品被称为AuAg@PC-Fe；

Step3、对材料的表征进行检测；

Step4、用808 nm激光照射AuAg和AuAg@PC-Fe 溶液(1 mL) 10分钟；

Step4、采用标准细胞计数Kit-8 (CCK8)法测定细胞活力，通过活/死细胞染色进一步评价AuAg@PC-Fe NPs的治疗效果；

Step5、利用2,2'-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)评价AuAg@PC-FeNPs的抗氧化性能以及近红外对自由基清除效果的影响；

Step6、用808 nm激光照射AuAg和AuAg@PC-Fe 溶液(1 mL) 3分钟,利用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)、SYTO9/PI活/死菌双染色试剂和菌落计数法检测细菌活力；

采用定量聚合酶链式反应(qPCR)检测RAW 264.7细胞中M1表型相关因子信使RNA(mRNA)表达水平:IL-6、TNF-α、il -1β和M2表型相关因子Arg-1、IL-10、TNF-β；

使用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞分泌的IL-6和IL-10；用流式细胞仪定量检测巨噬细胞标志物CD86和CD206的表达；

Step7、通过NF-κB/P65核移位和Nrf2(p-Nrf2)磷酸化来评估NF-κB和Nrf2信号通路受到的影响；确定AuAg@PC-Fe的抗炎机制；

Step8、制备动物模型，体内评估AuAg@PC-Fe对牙周病的抗炎作用；

将细菌连续注入下颌骨切牙4天；

除空白对照组外，其余各组均以0.2 mL /只大鼠原位给药3 d；

两组小鼠给药后均给予808nm近红外辐射(2.5 W/cm2)照射3 min；

用热成像仪观察温度变化。

2.根据权利要求1所述的一种金属多酚改性的金银纳米粒子制备方法，其特征在于，对材料的表征进行检测的方式包括：

利用透射电镜对AuAg NPs和AuAg@PC-Fe NPs的形态和结构进行分析；

通过动态光散射(DLS)记录尺寸分布，并使用Zetasizer仪器测定zeta电位；

进行x射线能谱(EDS)图谱和紫外-可见吸收光谱分析。

3.根据权利要求1所述的一种金属多酚改性的金银纳米粒子制备方法，其特征在于：在激光照射时，使用FLIR热成像仪(FLIRA-E50，美国)采集实时温度和红外图像。

4.根据权利要求1所述的一种金属多酚改性的金银纳米粒子制备方法，其特征在于：在确定AuAg@PC-Fe的抗炎机制时，利用Western blot检测抗氧化蛋白表达水平的方式：在冰中提取，用BCA蛋白测定试剂盒定量测定总蛋白；

经过聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白转移到聚偏氟乙烯膜上，在室温下封闭1小时；

将含有蛋白的膜用p-PI3K (1:2000),PI3K (1:2000,p-Akt (1:1000), p-Akt (1:1000), Akt (1:1000)， p-Nrf2 (S40) (1:2000;亲和力),Nrf2 (1:20 00;亲和力)，然后用辣根过氧化物酶偶联二抗体(1:1000;室温下保温1小时；

蛋白经ECL试剂盒(Beyotime)处理后在凝胶成像分析系统中可视化。