[发明专利]一种非典型毕赤酵母基因编辑系统及其应用

说明书

本发明涉及基因编辑技术领域，具体提供一种非典型毕赤酵母基因编辑系统及其应用。本发明提供非典型毕赤酵母基因编辑质粒，包含原核复制起点、抗性筛选标记基因、Cas9基因表达盒、gRNA基因表达盒和自主复制序列；所述Cas9基因表达盒从上游至下游依次包括Cas9基因启动子、Cas9基因和终止子；gRNA基因表达盒从上游至下游依次包括RNA polⅢ启动子、tRNA^Leu、引导序列、scaffold RNA序列和polyT。本发明的基因编辑质粒能够对PK酵母基因组进行编辑，且编辑效率高，操作方法简便。本发明的基因编辑质粒为PK酵母基因改造研究提供了一个很好的基因编辑系统。

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，尤其涉及一种非典型毕赤酵母基因编辑系统及其应用。

背景技术

基因编辑系统是进行基因与蛋白质功能研究必不可少的。ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9等技术的出现使基因编辑更加简便高效。

目前对CRISPR/Cas9基因编辑技术已有一定了解，应用于真核生物细胞中的CRISPR/Cas9系统主要由两部分构成：单链向导RNA(single-guide RNA，sgRNA)和Cas9蛋白。sgRNA用于替代CRISPR间隔序列转录形成的tracrRNA：crRNA复合物，负责引导Cas9蛋白结合到目标基因靶位点的前间隔子相邻基序列(protospacer adjacent motif，PAM)区域，随即触发Cas9蛋白上RuvC和HNH两个核酸酶功能位点的活性，对DNA链进行切割产生DSB。在sgRNA序列的设计上，sgRNA的3'端包含scaffold RNA序列，可转录形成茎环结构的双链RNA用于绑定Cas9蛋白，而5'端包含与目标基因靶点序列一致的引导序列。通过更改sgRNA上的引导序列，即可引导Cas9蛋白靶向任意存在PAM序列的DNA双链并切割，从而达到基因编辑的目的。

库德里阿兹威氏毕赤酵母(Pichia kudriavzevii，PK酵母)具有极强的抗逆性且生长迅速，是一种近年来备受关注的毕赤酵母。与传统酵母相比，对PK酵母的基因编辑系统的了解还非常有限，且其基因编辑系统尚未成熟。

发明内容

本发明提供一种非典型毕赤酵母基因编辑系统及其应用，用以解决现有技术中不存在PK酵母基因组编辑系统的缺陷，实现对PK酵母的快速有效编辑。

第一方面，本发明提供一种适用于PK酵母编辑的Cas9基因，所述Cas9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

现有技术已有的Cas9基因，不能实现对PK酵母的编辑，原因是：现有的Cas9基因大多是针对酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母等模式菌株而设计构建的，而PK酵母作为一种非模式菌株，其密码子使用频率与酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母的密码子使用频率有着较大不同。因此，需要对Cas9进行宿主密码子优化，使Cas9的密码子都为PK酵母中的高频密码子，从而更好地行使其功能。

第二方面，本发明提供一种引物对，所述引物对的序列如SEQ ID NO.14-15所示，用于扩增如SEQ ID NO.1所示的Cas9基因。

第三方面，本发明提供一种PK酵母基因编辑质粒，所述PK酵母基因编辑质粒包括：原核复制起点、抗性筛选标记基因、Cas9基因表达盒、gRNA基因表达盒和自主复制序列；所述Cas9基因表达盒含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

在本发明提供的PK酵母基因编辑质粒中，所述Cas9基因表达盒从上游至下游依次包括Cas9基因启动子、Cas9基因和终止子；

所述Cas9基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述Cas9基因终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。