[发明专利]一种非典型毕赤酵母基因编辑系统及其应用

权利要求书

1.一种适用于PK酵母编辑的Cas9基因，其特征在于，所述Cas9基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

2.一种引物对，其特征在于，所述引物对的序列如SEQ ID NO.14-15所示，用于扩增权利要求1所述的Cas9基因。

3.一种PK酵母基因编辑质粒，其特征在于，所述PK酵母基因编辑质粒包括：原核复制起点、抗性筛选标记基因、Cas9基因表达盒、gRNA基因表达盒和自主复制序列；

所述Cas9基因表达盒含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的PK酵母基因编辑质粒，其特征在于：

所述Cas9基因表达盒从上游至下游依次包括Cas9基因启动子、Cas9基因和终止子；

所述Cas9基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述Cas9基因终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.根据权利要求4所述的PK酵母基因编辑质粒，其特征在于，所述gRNA基因表达盒从上游至下游依次包括RNA polⅢ启动子、tRNA^Leu、引导序列、scaffold RNA序列和polyT；

优选地，所述gRNA基因表达盒由SEQ ID NO.6-7所示引物对扩增得到；

更优选地，所述gRNA基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

6.根据权利要求5所述的PK酵母基因编辑质粒，其特征在于，所述自主复制序列为酿酒酵母的ARS序列；所述ARS序列由SEQ ID NO.12-13所示引物对扩增得到；

优选地，所述ARS序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

7.根据权利要求6所述的PK酵母基因编辑质粒，其特征在于，所述筛选标记基因为氨苄青霉素抗性基因和博来霉素抗性基因；所述原核复制起点为pBR322的复制起始点。

8.权利要求3-7任一项所述PK酵母基因编辑质粒的构建方法，其特征在于，

以PK酵母基因组DNA为模板PCR扩增得到Cas9基因启动子和Cas9基因终止子；以合成质粒为模板PCR扩增得到gRNA基因表达盒和自主复制序列；

将SEQ ID NO.1-5所示的序列，连接到载体上，构建基因编辑质粒pk-Cas9，并转化大肠杆菌DH5α，获得重组质粒pk-Cas9。

9.权利要求1-2任一项所述的Cas9基因或权利要求3-7任一项所述的PK酵母基因编辑质粒在高效编辑PK酵母中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将感受态库德里阿兹威氏毕赤酵母，与pk-Cas9质粒和供体DNA混匀，冰浴后，电击转化，电击后立即加入山梨醇和YPD培养基中，进行复苏，获得编辑后的PK酵母。