[发明专利]葡萄糖异构酶突变体及其高产葡萄糖异构酶的地衣芽胞杆菌工程菌及应用

说明书

本发明属于微生物基因工程和蛋白质工程改造技术领域，具体涉及葡萄糖异构酶突变体及其高产葡萄糖异构酶的地衣芽胞杆菌工程菌及应用。申请人将葡萄糖异构酶第235位氨基酸由亮氨酸变为丙氨酸，通过构建重组表达载体，发现突变体TogI‑L235A的比活力达到了158.7U/mg，相比对照至少提高了16.4%。进一步通过筛选不同信号肽实现葡萄糖异构酶的胞外高效表达，酶活高达42.5U/mL，为工业生产葡萄糖异构酶奠定基础。

技术领域

本发明属于微生物基因工程和蛋白质工程改造技术领域，具体涉及葡萄糖异构酶突变体及其高产葡萄糖异构酶的地衣芽胞杆菌工程菌及应用。

背景技术

葡萄糖异构酶(GI)是高果糖浆工业的关键用酶，能可逆催化D-葡萄糖和D-果糖之间的异构转化，由于高果糖浆比蔗糖更有益于健康，并有着良好的发酵性能和适宜的口感，广泛应用于食品和饮料工业。强化表达葡萄糖异构酶基因以及提高酶与底物的亲和力是提高GI产量和酶活性的有效途径。目前常用于GI表达的工程宿主菌是大肠杆菌，且为胞内表达。为了更好满足食品工业的安全要求，从国际公认的食品工业安全宿主菌(GRAS)着眼，本专利使用地衣芽胞杆菌作为宿主菌。

地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)被认为是安全菌株，且能分泌大量的胞外蛋白，是一个很好的分泌表达系统。地衣芽胞杆菌BL10来源于野生菌地衣芽胞杆菌WX-02，该菌株缺失野生菌的胞外蛋白酶，作为表达宿主有利于外源蛋白的的分泌表达。葡萄糖异构酶已经在大肠杆菌和枯草芽胞杆菌中获得不同程度的表达，但还未有在地衣芽胞杆菌中分泌表达的报道。

发明内容

提高酶与底物亲和力是提高酶活性的有效措施，本申请的目的在于提供了葡萄糖异构酶突变体TogI-L235A，其比活力达到158.7U/mg，相比野生型提高了16.4％。

本发明的另一个目的在于提供了高产葡萄糖异构酶的地衣芽胞杆菌工程菌，该工程菌实现葡萄糖异构酶的胞外高效表达，酶活高达42.5U/mL。

本发明的最后一个目的在于提供了上述菌株在生产葡萄糖异构酶突变体中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

申请人通过PCR扩增获得来源于Thermus oshimai的葡萄糖异构酶基因togI，再将葡萄糖异构酶进行改造，相对于原始氨基酸序列，将其第235位氨基酸由亮氨酸变为丙氨酸、丝氨酸或异亮氨酸中的一种，获得突变体TogI-L235A、TogI-L235S、TogI-L235I。通过构建重组表达载体，发现突变体TogI-L235A的比活力达到了158.7U/mg，相比对照(即野生型)至少提高了16.4％，所述的葡萄糖异构酶突变体，为SEQ ID NO.1所示，编码其的基因为SEQID NO.2所示。

高产葡萄糖异构酶的地衣芽胞杆菌工程菌(Bacillus licheniformis)，其是将SEQ ID NO.3所述的蛋白表达载体转入地衣芽胞杆菌中获得，所述的地衣芽胞杆菌为表达外源蛋白的地衣芽孢杆菌。

以上所述的应用，优选的，所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌BL10

高产葡萄糖异构酶的地衣芽胞杆菌在制备葡萄糖异构酶中的应用，所述的应用过程是发酵，使用的发酵培养基为：

8-12g/L酵母粉、10-14g/L骨蛋白胨、9-12g/L玉米浆、17-22g/L蔗糖、1-5g/LKH₂PO₄、2-8g/L Na₂HPO₄、0.1-0.5g/L MgSO₄，pH 6.8-7.5。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：