[发明专利]增强表达糖苷水解酶编码基因APASM_6114转录水平以提高安丝菌素产量的方法

说明书

本发明公开了一种增强表达糖苷水解酶编码基因APASM_6114转录水平以提高安丝菌素产量的方法。具体来说，通过在珍贵束丝放线菌ATCC 31280中利用强启动子kasOp*增强表达珍贵束丝放线菌内源性糖苷水解酶编码基因APASM_6114，促进珍贵束丝放线菌的蔗糖消耗、提高碳源利用率，最终可明显提高安丝菌素产量。最终安丝菌素产量在实验室摇瓶发酵水平下达到63.7mg/L，较对照菌株提高36.9％。通过本发明可显著提高安丝菌素的发酵产量，同时实现发酵成本的降低。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种通过增强水解蔗糖的胞外糖苷水解酶编码基因APASM_6114转录水平以提高安丝菌素产量的方法；尤其涉及一种通过增强水解蔗糖的胞外糖苷水解酶编码基因的转录水平、提高菌体蔗糖消耗量、从而提高碳源利用率，最终提高安丝菌素发酵水平的方法。

背景技术

安丝菌素(Ansamitocin)是由珍贵束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)产生的一种大环内酰胺类抗生素，它能够与微管蛋白的β亚基结合，阻碍微管组装，从而抑制肿瘤细胞分裂。来自ImmunoGen，Inc.公司的Chari等人通过在C-3位酯基上连接二硫键形成DM1分子，经DTT还原后可与不同的抗体连接形成抗体-药物偶联物(ADC)。目前，衍生于安丝菌素的多种ADC药物已经进入不同的临床检定阶段，其中由罗氏公司开发的用于治疗人类乳腺癌的Trastuzumab Emtansine(即T-DM1)已经成药上市。除了抗肿瘤活性外，安丝菌素还能抑制真菌、酵母、昆虫等其它真核生物的生长与繁殖。

在安丝菌素的产生菌ATCC 31280的发酵过程中，蔗糖能够作为碳源被菌体有效利用，且一定浓度的蔗糖可为菌体生长提供碳骨架、能为初级代谢及次级代谢途径提供还原力、能量及提升次级代谢产物合成前体物的生成。本发明通过蛋白分级分离与活性追踪相结合的方式，找到了一个水解利用蔗糖的胞外糖苷水解酶及其编码基因：APASM_6114。通过增强水解蔗糖的胞外糖苷水解酶编码基因的转录水平可以提升菌体蔗糖消耗量，从而提高碳源利用率，最终可明显提高安丝菌素产量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种增强表达糖苷水解酶编码基因APASM_6114转录水平以提高安丝菌素产量的方法；具体来说，是一种通过增强水解蔗糖的胞外糖苷水解酶编码基因APASM_6114转录水平以提高安丝菌素发酵水平的方法；通过在珍贵束丝放线菌ATCC31280中增强表达内源性水解蔗糖的胞外糖苷水解酶编码基因APASM_6114，获得高产安丝菌素的突变菌株(ARE-11)，通过提升菌体碳源利用效率，最终提高安丝菌素的产量。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

第一方面，本发明涉及安丝菌素高产菌株，在珍贵束丝放线菌中增强表达水解蔗糖的胞外糖苷水解酶编码基因。

作为本发明的一个实施方案，所述胞外糖苷水解酶编码基因为APASM_6114，其序列如SEQ ID NO.1所示。该编码基因是负责蔗糖水解的珍贵束丝放线菌内源性胞外糖苷水解酶编码基因。

作为本发明的一个实施方案，所述珍贵束丝放线菌为Actinosynnema pretiosumsubsp.pretiosum ATCC 31280。此时，该安丝菌素高产菌株由珍贵束丝放线菌ATCC 31280中增强表达内源性水解蔗糖的胞外糖苷水解酶编码基因APASM_6114后获得，获得的突变株基于增强表达内源性负责蔗糖水解的糖苷水解酶编码基因APASM_6114，通过促进蔗糖消耗量、提升菌体碳源利用效率，从而提高安丝菌素产量。

第二方面，本发明涉及一种用于增强表达水解蔗糖的糖苷水解酶编码基因的整合型载体，所述载体包含(源于珍贵束丝放线菌的)胞外糖苷水解酶编码基因APASM_6114，其序列如SEQ ID NO.1。

作为本发明的一个实施方案，所述胞外糖苷水解酶编码基因来源于珍贵束丝放线菌ATCC 31280。