[发明专利]增强表达糖苷水解酶编码基因APASM_6114转录水平以提高安丝菌素产量的方法

权利要求书

1.一株安丝菌素高产菌株，其特征在于，在珍贵束丝放线菌Actinosynnema pretiosumsubsp.pretiosum ATCC 31280中增强表达水解蔗糖的胞外糖苷水解酶编码基因；所述胞外糖苷水解酶编码基因为APASM_6114，其序列是SEQ ID NO.1。

2.一种用于增强表达水解蔗糖的胞外糖苷水解酶编码基因的整合型质粒载体，其特征在于，所述载体包含胞外糖苷水解酶编码基因APASM_6114，其序列是SEQ ID NO.1。

3.一种根据权利要求2所述的整合型质粒构建方法，其特征在于，通过PCR扩增的方式分别从ATCC 31280基因组中获取APASM_6114基因片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pLQ648的NdeI/EcoRI位点。

4.一种安丝菌素高产菌株的构建方法，其特征在于，将如权利要求2所述的整合型质粒载体，或如权利要求3所述的构建方法得到的整合型质粒载体接合转移导入珍贵束丝放线菌中进行重组获得所述基因增强表达突变株。

5.根据权利要求4所述的安丝菌素高产菌株的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1，设计并构建用于增强表达胞外糖苷水解酶编码基因APASM_6114的整合型质粒；

S2，通过接合转移将所述整合型质粒导入受体菌株中，然后对突变株进行安普霉素抗性验证，并挑取菌丝体通过PCR产物片段大小的差异，筛选得到基因增强表达突变株。

6.一种提高安丝菌素发酵水平的方法，其特征在于，在珍贵束丝放线菌ATCC 31280中增强表达水解蔗糖的胞外糖苷水解酶编码基因，获得安丝菌素高产菌株；发酵，获得安丝菌素。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵包含下列步骤：将活化后的安丝菌素高产菌株接种于一级种子培养基中，30℃、220rpm条件下培养24小时；按3.3％-6.6％接种量转接至二级种子培养基中，30℃、220rpm的转速下培养24小时；按10％的接种量转接至发酵培养基中，25℃、220rpm的转速下发酵7天后，收集发酵液并进行萃取和安丝菌素产量检测。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述一级种子培养基包括:TSB 3w/v％、酵母提取物0.5w/v％、蔗糖7.0w/v％。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述二级种子培养基包括TSB 3w/v％、酵母提取物0.6-0.8w/v％、蔗糖7.0w/v％、异丁醇0.05v/v％、异丙醇0.05v/v％。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括酵母提取物3.3-6.6w/v％、麦芽提取物1w/v％、蔗糖7.0w/v％、缬氨酸40mmol/L、异丁醇0.5v/v％、异丙醇1.2v/v％、MgCl₂ 2mmol/L。