[发明专利]一种心肌细胞存活的体外培养方法

说明书

本发明提供了一种心肌细胞存活的体外培养方法，具体包括以下内容：将离体的心脏组织使用缓冲液进行冲洗，然后转入培养皿中，剪成组织碎片；将组织碎片转入EP管中，使用II型胶原酶与胰蛋白酶混合液进行初次消化，然后加入混有DNase I的II型胶原酶溶液进行多次短时消化；完成后，吸取EP管中的上清液后并将上清液放置于离心管中；进行离心并除去上清，收集细胞沉淀，再加入完全培养基，进行心肌细胞重悬等。本发明本发明培养的心机细胞搏动时间早、存活时间长、在较长的培养时间内维持高的细胞纯度，心肌成纤维细胞、纯度高、得率高_。

技术领域

本发明属于细胞体外培养技术领域，具体涉及一种心肌细胞存活的体外培养方法。

背景技术

心肌细胞体外培养能提供单一细胞的同源性集落，并且不受神经、体液因素影响，已成为研究心肌信号传导和药物筛选的基本方法之一。体外培养的心肌细胞中通常存在两大类：心肌细胞(myocardial cells)和心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CF)，还有少量的血管内皮细胞等。此外因其特殊的组织结构，心肌细胞在分离时极易受伤，心肌成纤维细胞在培养数代后也出现老化。而现有的心肌细胞的体外培养方法已有很多报道，但均存在细胞存活率低、纯度不高等问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种心肌细胞存活的体外培养方法，以解决上述背景技术中提出的问题。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种心肌细胞存活的体外培养方法，具体包括以下内容：

步骤1、将离体的心脏组织使用CBFHH缓冲液进行冲洗，然后转入盛有DMEM/F12基础培养基的培养皿中，将心脏组织剪成组织碎片；

步骤2、将组织碎片转入EP管中，使用II型胶原酶与胰蛋白酶混合液进行初次消化，然后加入混有DNase I的II型胶原酶溶液进行多次短时消化；

步骤3、消化完成后，吸取EP管中的上清液后并将上清液放置于离心管中，在离心管中预先放置含有胎牛血清的DMEM/F12完全培养基，离心管置于冰上；

步骤4、将离心管放置于离心机上进行离心并除去上清，收集细胞沉淀，再加入DMEM/F12完全培养基，进行心肌细胞重悬；

步骤5、放入在培养皿中进行贴壁50min，收集含较高纯度心肌细胞的细胞悬液，再次离心，使用含Brdu的心肌细胞培养液II重悬细胞沉淀，贴壁培养心肌细胞；

步骤6、培养50h后更换为含1％FBS的心肌细胞培养液III，长期培养心肌细胞。

优选的，所述步骤1中CBFHH缓冲液为含137mM NaCl，5.36mM KCl，0.81mM MgSO4﹒7H2O，5.55mM D-葡萄糖，0.44mM KH2PO4﹒7H2O，0.34mM NaH2PO4﹒2H2O及终浓度20mMHEPES。

优选的，所述步骤2中酶消化液中Ⅱ-型胶原酶的质量百分比浓度为0.04％，胰蛋白酶的质量百分比浓度为0.09％。

优选的，所述步骤2中混有DNase I的II型胶原酶溶液组成为0.001％DNaseI的0.8mg/mL的II型胶原酶溶液。

优选的，所述步骤2中初次消化具体内容为：将EP管置于35～40℃水浴条件中进行第一次消化，消化时间为6～10分钟，消化完毕后吸取上清液后并弃去；短时消化具体内容为：将EP管置于35～40℃水浴条件中，消化时间为3～4分钟。

优选的，所述步骤4和步骤5中离心转速为1200rpm，离心时间为7min。

本发明的技术效果和优点：本发明本发明培养的心机细胞搏动时间早、存活时间长、在较长的培养时间内维持高的细胞纯度，心肌成纤维细胞、纯度高、得率高。

具体实施方式

实施例1