[发明专利]一种心肌细胞存活的体外培养方法

权利要求书

1.一种心肌细胞存活的体外培养方法，其特征在于，具体包括以下内容：

步骤1、将离体的心脏组织使用CBFHH缓冲液进行冲洗，然后转入盛有DMEM/F12基础培养基的培养皿中，将心脏组织剪成组织碎片；

步骤2、将组织碎片转入EP管中，使用II型胶原酶与胰蛋白酶混合液进行初次消化，然后加入混有DNase I的II型胶原酶溶液进行多次短时消化；

步骤3、消化完成后，吸取EP管中的上清液后并将上清液放置于离心管中，在离心管中预先放置含有胎牛血清的DMEM/F12完全培养基，离心管置于冰上；

步骤4、将离心管放置于离心机上进行离心并除去上清，收集细胞沉淀，再加入DMEM/F12完全培养基，进行心肌细胞重悬；

步骤5、放入在培养皿中进行贴壁50min，收集含较高纯度心肌细胞的细胞悬液，再次离心，使用含Brdu的心肌细胞培养液II重悬细胞沉淀，贴壁培养心肌细胞；

步骤6、培养50h后更换为含1％FBS的心肌细胞培养液III，长期培养心肌细胞。

2.根据权利要求1所述的一种心肌细胞存活的体外培养方法，其特征在于：所述步骤1中CBFHH缓冲液为含137mM NaCl，5.36mM KCl，0.81mM MgSO4﹒7H2O，5.55mM D-葡萄糖，0.44mM KH2PO4﹒7H2O，0.34mM NaH2PO4﹒2H2O及终浓度20mM HEPES。

3.根据权利要求1所述的一种心肌细胞存活的体外培养方法，其特征在于：所述步骤2中酶消化液中Ⅱ-型胶原酶的质量百分比浓度为0.04％，胰蛋白酶的质量百分比浓度为0.09％。

4.根据权利要求1所述的一种心肌细胞存活的体外培养方法，其特征在于：所述步骤2中混有DNase I的II型胶原酶溶液组成为0.001％DNaseI的0.8mg/mL的II型胶原酶溶液。

5.根据权利要求1所述的一种心肌细胞存活的体外培养方法，其特征在于：所述步骤2中初次消化具体内容为：将EP管置于35～40℃水浴条件中进行第一次消化，消化时间为6～10分钟，消化完毕后吸取上清液后并弃去；短时消化具体内容为：将EP管置于35～40℃水浴条件中，消化时间为3～4分钟。

6.根据权利要求1所述的一种心肌细胞存活的体外培养方法，其特征在于：所述步骤4和步骤5中离心转速为1200rpm，离心时间为7min。