[发明专利]一种基于伴侣蛋白GroEL保护的荧光金纳米簇、制备方法及其应用

说明书

一种基于伴侣蛋白GroEL保护的荧光金纳米簇、制备方法及其在GroEL抑制剂筛选中的应用，属于荧光探针技术领域。该荧光探针是以三水合氯金酸(HAuCl₄·3H₂O)作为Au源，GroEL蛋白作为还原剂和最终的配体稳定剂，利用GroEL蛋白制备荧光金纳米簇此前从未报道过，实验证明该荧光金纳米簇具有良好的荧光稳定性；而且，基于伴侣蛋白GroEL保护的荧光金纳米簇的GroEL蛋白基本保留了原有的二级结构，并在类ATP酶(ATPase‑like)的活性测试中表现出未丧失原有的活性。因此，可基于保留完好的蛋白结构和功能，利用AuNCs@GroEL良好的发光性能用于GroEL抑制剂的筛选。

技术领域

本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种基于伴侣蛋白GroEL保护的荧光金纳米簇、制备方法及其在GroEL抑制剂筛选中的应用。

背景技术

GroEL是一种来源于大肠杆菌的蛋白质，由两个堆叠的七聚环亚基组成桶状结构，每个亚基大小为57kDa，它对新合成肽链的折叠和组装具有重要的辅助作用^[1]。众所周知，天然正确折叠形成的蛋白质对生物体行使其正常的生理功能具有重要作用；然而，错误折叠的蛋白质(即非天然多肽)容易引起蛋白质聚集而失能，甚至导致危害。GroEL可与共伴侣分子GroES(70kDa的同型七聚体)协同作用，以ATP依赖的方式将暴露在疏水区域的非天然多肽转移至具有疏水残基的GroEL空腔内；随后，ATP水解导致底物释放能量，辅助新生肽链正确折叠^[2]。因此，GroEL和GroES对细菌体内蛋白质的正确折叠、最终保障其行使正常功能具有重要作用。此外，由于所有细菌中都含有至少一种(在所有条件下都必不可少的)GroEL同源物，所以GroEL对细菌的生长也至关重要。因此，开发靶向GroEL的抑制剂则可作为一种重要且具有广谱适用性的抗菌手段，能有效避免抗生素导致的耐药菌的产生。然而，目前对GroEL抑制剂的相关研究还处于初级阶段，筛选GroEL有效抑制剂具有重要的研究意义^[3]。再则，GroEL因其特殊的笼状结构以及ATP利用机制还可作为疏水性药物的运输机器，据报道GroEL可作为肿瘤药物的天然靶向载体^[4]。因此，开发带有荧光标签的GroEL对研究其作用机制、发挥其功能，以及进一步拓展其应用均具有重要的科学意义。

具有较小尺寸(≤2.2纳米)的金属纳米簇(NCs)在受到适当配体保护时可发出荧光。相比于传统的荧光染料，蛋白质中的部分氨基酸(络氨酸、半胱氨酸等)残基可以作为金属离子的还原剂，允许形成稳定的、蛋白保护的金属纳米簇；而且，由于NCs的尺寸较小，一般不会明显改变蛋白质原有的二级结构和生物功能^[5]。作为细菌生长的重要蛋白，GroEL蛋白序列上含有的络氨酸和半胱氨酸(Cys)残基可作为还原剂将氯金酸还原成金原子，并以保护配体的形式将其稳定，因此可用来制备具有荧光效应的金纳米簇。利用生物大分子蛋白质合成的荧光NCs具有安全性高、生物相容性好、以及稳定性高等特点。

此外，将GroEL与病毒衣壳蛋白在大肠杆菌中共表达可以提高目标蛋白的可溶性表达，进而在离心纯化后使其可以大量分布在上清溶液中，有效提高目标蛋白的表达和纯化效率。然而，与目标蛋白分离后的GroEL蛋白常被视为已完成使命的废弃物而被丢弃，造成浪费。本发明利用这些废弃的GroEL蛋白来制备荧光金属钠米簇，不但基于废物利用提供了一种新型荧光材料AuNCs@GroEL，尤其是可以以此为荧光探针来揭示GroEL与其它蛋白质相互作用，并可基于所含AuNCs的荧光变化来筛选GroEL抑制剂，对深入揭示GroEL功能和作用机制将具有非常重要的科学意义。

发明内容