[发明专利]一种抗菌物质吉类菌素的制备及重组表达方法和医用用途

说明书

本发明公开了一种抗菌物质吉类菌素的制备及重组表达方法和医用用途，从吉林类芽孢杆菌培养上清中纯化得到一种新型细菌素类抗菌物质‑‑吉类菌素，确定了其氨基酸序列特征和编码基因，应用大肠杆菌原核表达系统获得了具有抗菌活性的重组吉类菌素。吉类菌素具有强抗菌活性，较宽抗菌谱，优良稳定性，极低细胞毒性和溶血活性，并且不产生耐药性。牛奶保鲜应用分析显示，吉类菌素能高效杀灭牛奶中的屎肠球菌，延长牛奶保存期，且不影响牛奶品质。动物抗感染实验表明，吉类菌素对小鼠耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染具有显著治疗作用。

技术领域

本发明公开一种吉类菌素，为一种新型抗菌物质，尤其是提供了吉类菌素的制备及重组表达方法，同时还提供了吉类菌素在制备抗细菌感染药物中的医用用途，属于生物医药技术领域。

背景技术

耐药细菌对动物养殖和人类健康构成了巨大威胁，开发能有效抵抗耐药细菌的新型抗菌物质显然已成为迫切需要。然而正在研发的化学合成抗生素很少，而且其中大多数是当前抗生素的衍生物。因此，不断寻求新型抗菌药物已成为人们的共识。畜禽养殖中抗生素类药物作为饲料添加剂和治疗药物广为使用，但抗生素的长期不合理使用，带来严重的安全性问题如药物残留和病原菌耐药性扩散。故而寻找高效、广谱、无残留、无耐药性、低副作用的抗生素替代品，是近些年来人们一直努力的目标。抗菌蛋白或多肽具有独特的结构序列、作用机制和高效的杀菌效果，同时和传统的抗生素基本不会产生交叉耐药现象，因而是抗生素的最佳替代品。

细菌素是微生物在进化过程中产生的一类防御分子，是由特定细菌产生的蛋白质或多肽，能抑制其他微生物定植和生长。细菌素类抗菌蛋白或多肽体现出对耐药致病菌杀菌活性强，而对于益生菌杀菌活性弱的特征。细菌素的这种选择性作用，使其在纠正肠道菌群失调和拮抗致病菌方面具有良好优势。细菌素不易诱导致病菌耐药性产生，对真核细胞毒性低，易于降解和残留少。细菌素类抗菌蛋白或多肽因其独特的结构序列、作用机制和高效杀菌效果，不易产生耐药性，同时和传统抗生素基本不会产生交叉耐药，有着广阔的应用前景，成为新一代的抗生素替代品而备受青睐。乳酸乳球菌产生的乳酸链球菌素（也称乳链菌肽、Nisin）是发现早、研究清楚的细菌素，自1950年以来已作为食品防腐剂和兽药得以广泛应用。

发明内容

本发明公开的一种吉类菌素，为一种新型含SIMPL结构域蛋白，属于细菌素样抗菌物质，由吉林类芽孢杆菌产生的抗菌物质，它显示可以拮抗多种病原菌的生长，具有抗感染的医用用途。

本发明所述的一种吉类菌素，是由吉林类芽孢杆菌（中国专利CN 112574929 A中公开了从鸡肠道分离获得的芽孢杆菌属菌种）产生的抗菌物质，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供的一种吉类菌素的纯化制备方法，包括如下步骤：

1、发酵上清制备：将-80℃冻存的吉林类芽孢杆菌在TSB平板划线，37℃培养至形成单菌落，然后挑取单菌落至3ml TSB液体培养基中，37℃、200rpm摇晃培养12h，然后以1%比例转接至5L TSB液体培养基中，37℃、200rpm摇晃培养10 h，10000rpm离心10min，0.22μm滤器过滤得发酵上清；

2、粗提液制备：将发酵上清以70%饱和度的硫酸铵进行4℃沉淀过夜，之后10000rpm离心20min，收集沉淀，以蒸馏水复溶之后用1000 Da的透析袋进行透析，直至硫酸铵被完全去除，然后冷冻干燥获得粗提物；

3、纯化：将粗提物应用凝胶过滤层析和HPLC进行纯化。将粗提物通过Sephadex G-75凝胶过滤层析柱，流速1ml/min，以0.22μm滤膜过滤的无菌蒸馏水进行洗脱，以280nm为检测波长，收集各洗脱峰，测定抗菌活性确定目标峰；将目标峰利用C18液相色谱柱经HPLC进行进一步纯化，流动相为A，蒸馏水；B：乙腈，0-20min线性洗脱，多次重复进样后，将抗菌目标峰合并，冷冻干燥获得吉类菌素。

本发明进一步提供了吉类菌素的重组表达方法，包括以下步骤：