[发明专利]一种抗菌物质吉类菌素的制备及重组表达方法和医用用途

权利要求书

1.一种吉类菌素，其特征在于：是由吉林类芽孢杆菌产生的抗菌物质，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述的吉类菌素的制备方法，包括如下步骤：

（1）发酵上清制备：

将-80℃冻存的吉林类芽孢杆菌在TSB平板划线，37℃培养至形成单菌落，然后挑取单菌落至3ml TSB液体培养基中，37℃、200rpm摇晃培养12h，然后以1%比例转接至5L TSB液体培养基中，37℃、200rpm摇晃培养10 h，10000rpm离心10min，0.22μm滤器过滤得发酵上清；

（2）粗提液制备：

将发酵上清以70%饱和度的硫酸铵进行4℃沉淀过夜，之后10000rpm离心20min，收集沉淀，以蒸馏水复溶之后用1000 Da的透析袋进行透析，直至硫酸铵被完全去除，然后冷冻干燥获得粗提物；

（3）纯化：

将粗提物应用凝胶过滤层析和HPLC进行纯化；将粗提物通过Sephadex G-75凝胶过滤层析柱，流速1ml/min，以0.22μm滤膜过滤的无菌蒸馏水进行洗脱，以280nm为检测波长，收集各洗脱峰，测定抗菌活性确定目标峰；进一步将目标峰利用C18液相色谱柱经HPLC进行纯化，流动相为A，蒸馏水；B：乙腈，0-20min线性洗脱，多次重复进样后，将检测具有抗菌作用的活性峰合并，冷冻干燥获得吉类菌素。

3.权利要求1所述的吉类菌素的一种重组表达方法，其特征在于步骤为：

1）基因片段扩增：

设计相应引物，扩增吉类菌素基因片段，经酶切和连接，构建表达载体pET28a，并且通过转化构建表达菌株大肠杆菌BL21（DE3）；

引物如下：

JC-1 F: CTGGGATCCAATGTAGTTAATGTGGTTGGC；

R: CTGCTCGAGCTATTTAAGCTCATATTGTACACTC；

JC-2 F: CTGGGATCCATGAAAATTTGGGTCAAATC；

R: CTGCTCGAGCTATTTAAGCTCATATTGTACACT；

JC-25 F: CTGGGATCCGGAGATCTGTTAAGCGGAGCT；

R: CTGCTCGAGCTATTTAAGCTCATATTGTACACTC；

JC-37 F: CTGGGATCCGATGAAGCCGTGCAGCGCAAT；

R: CTGCTCGAGCTATTTAAGCTCATATTGTACACTC；

2）诱导表达：

16℃，180 rpm，LB培养基中培养，应用1 mM咪唑诱导24 h；

3）纯化：

应用镍柱进行亲和层析纯化，分别用20 mM、100mM、500 mM咪唑进行洗脱，收集500 mM咪唑洗脱部分，应用超滤除去咪唑等杂质，之后冷冻干燥纯化得到重组表达吉类菌素。

4.权利要求1所述的吉类菌素在制备治疗金黄色葡萄球菌感染药物的用途。

5.权利要求1所述的吉类菌素在制备治疗小鼠和大蜡螟幼虫金黄色葡萄球菌感染药物中的用途。

6.权利要求1所述的吉类菌素在食品保鲜剂中的用途。

7.权利要求1所述的吉类菌素在制备牛奶保鲜剂中的应用。