[发明专利]猪HBB基因定点修饰系统及应用

说明书

本发明公开了猪HBB基因定点修饰系统及应用。本发明提供用于猪HBB基因定点修饰的系统，该系统中含有的第一载体、第二载体和第三载体可以表达基因编辑蛋白和sgRNA，对HBB基因的三个靶位点进行有效酶切，利用供体DNA的定点修饰片段替换位靶位的待定点修饰片段，实现HBB基因CDS序列第176～179位碱基精确删除。精准模拟我国人群最常见的β地中海贫血突变基因型β^{41‑42(‑CTTT)}模型，为我国人群β地中海贫血病发病机制解析，新型治疗方法开发提供精准模型。

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，具体地说，涉及猪HBB基因定点修饰系统及应用。

背景技术

β地中海贫血是一种常见的隐性遗传性常染色体血液疾病，主要由于β珠蛋白基因的缺失或突变导致β珠蛋白链合成障碍引起α与非α珠蛋白链合成失去平衡而导致的溶血性贫血。据现有流行病学调查资料显示，广东省人群的β地中海贫血基因携带率高达2.54％，广西地区人群β-地中海贫血基因携带率高达6.78％～7.97％。在东南亚国家以及我国南方各省人群中，β珠蛋白基因CD41-42(-CTTT)突变约占β地中海贫血突变的36％以上，其纯合子表现为重型地中海贫血。合适的动物模型是研究β-地中海贫血的发生机制、基因治疗效果的重要手段。尽管β地中海贫血动物模型发展很快，但是这些动物模型大多是基于国外较常见的IVS-2-654突变，并不包括中国人群的β-珠蛋白基因主要突变位点CD41-42(-CTTT)。因此，建立精准模拟人类β^{CD41-42(-CTTT)}突变基因的疾病模型，对于我国β地中海贫血的发生机制、新型治疗方法开发显得尤为重要。猪是非常好的人类疾病模型动物，在器官大小、生理、病例理等方面都与人非常接近，利用猪制备β地中海贫血疾病模型，其应用价值远远高于小鼠、大鼠、兔等小型动物，对治疗人类β地中海贫血具有更为重要的参考价值。

发明内容

本发明的目的是提供猪HBB基因定点修饰系统及应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供靶向猪HBB基因的CRISPR/Cas载体，其sgRNA作用位点的核苷酸序列选自如SEQ ID NO：1、2或3所示序列中的至少一条。

优选地，其sgRNA作用位点的核苷酸序列选自SEQ ID NO：1、2或3中的任意两条。

第二方面，本发明提供一种猪HBB基因定点修饰系统，包含所述的CRISPR/Cas载体以及供体DNA。

其中，所述供体DNA含有猪HBB基因第2外显子定点修饰片段，所述定点修饰片段是指将猪HBB基因的第176～179位碱基删除。

进一步地，所述CRISPR/Cas载体包含基因编辑蛋白表达盒和sgRNA表达盒。

所述基因编辑蛋白可选自Cas9、Cas9n、Cpf1或C2c2等，优选Cas9。

所述CRISPR/Cas载体的骨架载体可选自pX330、pX260、pX334、pX335、pX458、pX459、pX461、pX462、pX551或pX552等，优选pX458。

进一步地，当sgRNA作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示时，供体DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

进一步地，当sgRNA作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示时，供体DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

进一步地，当sgRNA作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示时，供体DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

第三方面，本发明提供所述系统的以下任一应用：

(a)构建HBB基因定点修饰的细胞系；

(b)制备人类p地中海贫血细胞系模型；