[发明专利]猪HBB基因定点修饰系统及应用在审
| 申请号： | 202211269986.3 | 申请日： | 2022-10-17 |
| 公开（公告）号： | CN116064665A | 公开（公告）日： | 2023-05-05 |
| 发明（设计）人： | 李奎;刘志国;牟玉莲 | 申请（专利权）人： | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N5/10;C12N15/877;A01K67/027 |
| 代理公司： | 北京众合诚成知识产权代理有限公司 11246 | 代理人： | 林月俊 |
| 地址： | 100193 *** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | hbb 基因 定点 修饰 系统 应用 | ||
1.靶向猪HBB基因的CRISPR/Cas载体，其特征在于，其sgRNA作用位点的核苷酸序列选自如SEQ ID NO：1、2或3所示序列中的至少一条。
2.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas载体，其特征在于，其sgRNA作用位点的核苷酸序列选自SEQ ID NO：1、2或3中的任意两条。
3.猪HBB基因定点修饰系统，其特征在于，包含权利要求1或2所述的CRISPR/Cas载体以及供体DNA；
所述供体DNA含有猪HBB基因第2外显子定点修饰片段，所述定点修饰片段是指将猪HBB基因的第176～179位碱基删除。
4.根据权利要求3所述的系统，其特征在于，所述CRISPR/Cas载体包含基因编辑蛋白表达盒和sgRNA表达盒。
5.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，所述基因编辑蛋白选自Cas9、Cas9n、Cpf1或C2c2，优选Cas9；和/或
所述CRISPR/Cas载体的骨架载体选自pX330、pX260、pX334、pX335、pX458、pX459、pX461、pX462、pX551或pX552，优选pX458。
6.根据权利要求4或5所述的系统，其特征在于，当sgRNA作用位点的核苷酸序列如SEQID NO：1所示时，供体DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；和/或
当sgRNA作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示时，供体DNA的核苷酸序列如SEQID NO：5所示；和/或
当sgRNA作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示时，供体DNA的核苷酸序列如SEQID NO：6所示。
7.权利要求4-6任一项所述系统的以下任一应用：
(a)构建HBB基因定点修饰的细胞系；
(b)制备人类β地中海贫血细胞系模型；
(c)构建人类β地中海贫血猪模型。
8.猪HBB基因定点修饰细胞的制备方法，其特征在于，包括向目的细胞中导入权利要求4-6任一项所述系统，得到HBB基因定点修饰的细胞；
优选地，所述目的细胞为猪成纤维细胞，更优选猪胎儿成纤维细胞；
优选地，导入的方法包括电穿孔法或脂质体转染法。
9.按照权利要求8所述方法制备得到的猪HBB基因定点修饰细胞。
10.HBB基因定点修饰的基因编辑猪的制备方法，其特征在于，将权利要求9所述细胞移植入去核的猪卵母细胞，得到重组克隆胚胎，将所述重组克隆胚胎移植入母猪体内经妊娠，得到HBB基因定点修饰的基因编辑猪。
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