[发明专利]一种体外诱导IPS细胞分化生成人心肌细胞的方法

说明书

本发明公开了一种体外诱导IPS细胞分化生成人心肌细胞的方法，具体包括下列步骤：(1)将生长良好的IPS细胞用胶原酶消化吹散为单细胞悬浮液之后使用培养基培养，对细胞进行传代培养；(2)将传代培养至4代的IPS细胞接种至盛装有诱导分化培养基的培养皿中，诱导分化培养基上添加有心肌分化添加剂A；(3)之后转移至添加有心肌分化添加剂B的诱导分化培养基上继续进行诱导分化；(4)之后转移至添加有心肌分化添加剂C的诱导分化培养基上继续进行诱导分化；(5)最后采用低血清培养基对细胞进行诱导分化。本发明涉及细胞培养技术领域，具体提供了一种方法简单，且分化效率稳定高效的体外诱导IPS细胞分化生成人心肌细胞的方法。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体为一种体外诱导IPS细胞分化生成人心肌细胞的方法。

背景技术

心脏疾病在国内外的发病率和死亡率已居于首位，成为严重危害人类健康的疾病之一。大多数病人由于缺血性或其他病理性损伤从而导致心肌受损，出现心脏功能不足，严重威胁生命。干细胞具有高度自我更新、增殖和多向分化潜能、可植入性及具备重建能力等特征，在再生医学领域具有不可估量的医学价值和诱人的应用前景。这些年，随着干细胞技术的深入发展，利用干细胞分化的心肌细胞为损伤心肌修复和替代治疗提供了可能。

目前，关于心肌细胞的分化技术已经有许多种方法，目前，关于心肌细胞的分化技术的缺点主要有以下几个方面：(1)现有的分化方法仍不成熟，表现为可重复性差、分化效率不稳定；(2)分化方法复杂，所需成本较高；(3)分化的心肌细胞纯度低、安全性较低、均一性差；(4)诱导的心肌细胞移植到动物体内，存在心率失常、致瘤性和重塑心脏结构差等问题。

发明内容

针对上述情况，为弥补上述现有缺陷，本发明提供了一种方法简单，且分化效率稳定高效的体外诱导IPS细胞分化生成人心肌细胞的方法。

本发明提供如下的技术方案：本发明提出的一种体外诱导IPS细胞分化生成人心肌细胞的方法，具体包括下列步骤：

(1)将生长良好的IPS细胞用胶原酶消化吹散为单细胞悬浮液之后使用mTeSR1培养基培养，当细胞密度达到80～85％时，吸走干细胞培养基，然后进行洗涤，对细胞进行传代培养；

(2)将传代培养至4代的IPS细胞以8×10³～1×10⁴/cm²的密度接种至盛装有诱导分化培养基的培养皿中，所述诱导分化培养基上添加有心肌分化添加剂A，培养至细胞密度达85％以上时进行诱导分化1天；

(3)之后转移至添加有心肌分化添加剂B的诱导分化培养基上继续进行诱导分化2～3天；

(4)之后转移至添加有心肌分化添加剂C的诱导分化培养基上继续进行诱导分化4～6天；

(5)最后采用低血清培养基对细胞进行诱导分化25～30天即可得到人心肌细胞，所述低血清培养基中添加有心肌分化添加剂D，在采用低血清培养基培养的第2～3天能观察到心肌细胞的跳动；

所述诱导分化培养基为含有B27添加剂的含糖1640培养基。

进一步地，所述培养环境为5％CO₂、37℃温度。

进一步地，所述心肌分化添加剂A包括3～20μM的组蛋白乙酰化酶抑制剂、1～5μM的DNA甲基化转移酶抑制剂和2～15μM的GSK-3抑制剂。

进一步地，所述心肌分化添加剂B包括0.2～5μM的视黄酸和10～25μM的IWP2。

进一步地，所述心肌分化添加剂C包括2～10μM的Wnt抑制剂、3～10mg/ml的乳糖和6～15μM环孢菌素A。