[发明专利]一种体外诱导IPS细胞分化生成人心肌细胞的方法

权利要求书

1.一种体外诱导IPS细胞分化生成人心肌细胞的方法，其特征在于，具体包括下列步骤：

(1)将生长良好的IPS细胞用胶原酶消化吹散为单细胞悬浮液之后使用mTeSR1培养基培养，当细胞密度达到80～85％时，吸走干细胞培养基，然后进行洗涤，对细胞进行传代培养；

(2)将传代培养至4代的IPS细胞以8×10³～1×10⁴/cm²的密度接种至盛装有诱导分化培养基的培养皿中，所述诱导分化培养基上添加有心肌分化添加剂A，培养至细胞密度达85％以上时进行诱导分化1天；

(3)之后转移至添加有心肌分化添加剂B的诱导分化培养基上继续进行诱导分化2～3天；

(4)之后转移至添加有心肌分化添加剂C的诱导分化培养基上继续进行诱导分化4～6天；

(5)最后采用低血清培养基对细胞进行诱导分化25～30天即可得到人心肌细胞，所述低血清培养基中添加有心肌分化添加剂D，在采用低血清培养基培养的第2～3天能观察到心肌细胞的跳动；

所述诱导分化培养基为含有B27添加剂的含糖1640培养基。

2.根据权利要求1所述的一种体外诱导IPS细胞分化生成人心肌细胞的方法，其特征在于，所述培养环境为5％CO₂、37℃温度。

3.根据权利要求1所述的一种体外诱导IPS细胞分化生成人心肌细胞的方法，其特征在于，所述心肌分化添加剂A包括3～20μM的组蛋白乙酰化酶抑制剂、1～5μM的DNA甲基化转移酶抑制剂和2～15μM的GSK-3抑制剂。

4.根据权利要求1所述的一种体外诱导IPS细胞分化生成人心肌细胞的方法，其特征在于，所述心肌分化添加剂B包括0.2～5μM的视黄酸和10～25μM的IWP2。

5.根据权利要求1所述的一种体外诱导IPS细胞分化生成人心肌细胞的方法，其特征在于，所述心肌分化添加剂C包括2～10μM的Wnt抑制剂、3～10mg/ml的乳糖和6～15μM环孢菌素A。

6.根据权利要求1所述的一种体外诱导IPS细胞分化生成人心肌细胞的方法，其特征在于，所述心肌分化添加剂D包括6～18μM的成纤维细胞生长因子-2、10～18μM的骨形态发生蛋白-2、5～20μM的血内管皮生长因子和3～12μM胰岛素样生长因子。

7.根据权利要求1所述的一种体外诱导IPS细胞分化生成人心肌细胞的方法，其特征在于，所述诱导分化培养基与心肌分化添加剂的体积比为(40～60)：1。