[发明专利]低成瘤性的MDCK细胞株及其构建方法和应用

说明书

本发明提供低成瘤性MDCK细胞株及其构建方法和应用。本发明自噬相关基因敲除的MDCK细胞株通过CRISPR Cas9基因编辑系统敲除lc3基因或者sqstm1基因，整体上获得了低成瘤性的细胞株，应用安全性更高。

技术领域

本发明涉及细胞应用技术领域，具体涉及低成瘤性MDCK细胞株及其构建方法和应用。

背景技术

成瘤性是指基质细胞在动物体内形成肿瘤的特性。《中国药典》规定新建细胞系/株及新型细胞基质应进行成瘤性检查。因此用于疫苗生产的细胞系都应进行成瘤性检查，而对已经进行过成瘤性检查的细胞，若其进行过基因方面的改造，则也同样应该检查成瘤性。目前，已证明具有成瘤性的常用细胞有CHO、BHK21、MDCK等细胞。

其中，MDCK细胞是正常犬肾来源的传代细胞，其是由Madin和Darby从考克斯班尼犬的肾脏组织中分离培养获得，此类肾脏细胞在原代培养时形态类似成纤维细胞。目前，MDCK细胞常用于病毒的扩增、纯化和检测，被认为是最适用于病毒疫苗生产的细胞系之一，因此有必要探究构建具有低成瘤性的MDCK细胞株。

发明内容

基于此，有必要提供低成瘤性MDCK细胞株及其构建方法和应用，通过基因编辑敲除MDCK细胞株中的自噬相关基因获得低成瘤性的细胞株，应用安全性更好。

本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种低成瘤性MDCK细胞株，所述MDCK细胞株的自噬相关基因被敲除。

所述低成瘤性MDCK细胞株为MDCK-lc3KO细胞株，于2022年9月9日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：武汉大学，请求保藏的培养物培养物分类命名为：基因缺失的犬肾细胞MDCK-lc3KO，保藏编号为CCTCC NO:C2022288。

所述低成瘤性MDCK细胞株为MDCK-sqstm1KO细胞株，于2022年9月9日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：武汉大学，请求保藏的培养物分类命名为：基因缺失的犬肾细胞MDCK-sqstm1KO，保藏编号为CCTCC NO:C2022289。

本发明还提供低成瘤性MDCK细胞株的构建方法，包括如下步骤：采用CRISPR Cas9基因编辑系统来敲除MDCK细胞中的自噬相关基因；验证自噬相关基因敲除的MDCK细胞株的成瘤性。

在其中一些实施例中，所述自噬相关基因为lc3基因，针对lc3基因靶点序列为：GCCGGTCCGAGGGCATCGCG。基于CRISPR Cas9基因编辑系统来敲除lc3基因的gRNA序列如SEQID NO:1、SEQ ID NO:2所示。针对lc3基因敲除所构建的载体采用的5’同源臂和3’同源臂的序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。

在其中一些实施例中，所述自噬相关基因为sqstm1基因，针对sqstm1基因靶点序列为：CCATGCGCTCAGGAGGCACC。基于CRISPR Cas9基因编辑系统来敲除sqstm1基因的gRNA序列如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14所示。针对sqstm1基因敲除所构建的载体采用的5’同源臂和3’同源臂的序列如SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示。

上述低成瘤性MDCK细胞株可以在培养病毒、制备病毒疫苗中进行应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明采用CRISPR-Cas9基因编辑方法，成功得到了自噬相关基因敲除的MDCK-lc3-KO和MDCK-sqstm1-KO细胞株，并且经验证MDCK-lc3-KO和MDCK-sqstm1-KO细胞株的成瘤性较原始MDCK细胞显著降低，应用更安全。

附图说明

图1为pX330以及pY75质粒图谱(a：pX330，b：pY75)。