[发明专利]新型重组痘苗病毒VV-IL-37的构建方法和应用

说明书

新型重组痘苗病毒VV‑IL‑37的构建方法和应用，涉及癌症治疗技术领域，包括如下步骤：步骤(一)重组质粒pEGFP‑IL‑37‑N1的构建：经过引物设计、扩增、酶切、琼脂糖凝胶电泳、胶回收、连接、转化、摇菌、质粒提取步骤得到pEGFP‑IL‑37‑N1质粒；步骤(二)重组痘苗病毒VV‑IL‑37/VV‑IL‑37‑GFP的生成与包装，采用该方法构建的重组痘苗病毒VV‑IL‑37‑GFP具有强感染能力和优异的IL‑37基因表达能力，且该新型重组痘苗病毒VV‑IL‑37可用于在制备肝癌药物。

技术领域

本发明涉及癌症治疗技术领域，具体涉及新型重组痘苗病毒VV-IL-37的构建方法和应用。

背景技术

肝癌是最常见的高致死性的恶性实体肿瘤疾病之一，其治疗一直是临床的重点和难点。由于肝癌具有严重的耐药特性，目前临床使用的化疗药物难以达到可期的治疗效果，且副作用明显。当肝癌病程进入晚期时，现有的治疗手段更是收效甚微。因此，寻找和开发新的治疗药物和手段，是提高肝癌临床治疗效果的关键。

病毒基因工程药物作为有望大幅提高癌症治疗效果甚至攻克癌症的新型药物，进一步开发和发展此类药物，是突破肝癌临床治疗局限的重要方向之一。

发明内容

基于以上不足，本发明提出新型重组痘苗病毒VV-IL-37的构建方法，采用该方法构建的重组痘苗病毒VV-IL-37-GFP具有强感染能力和优异的IL-37基因表达能力，且该新型重组痘苗病毒VV-IL-37可用于在制备肝癌药物。

本发明提供如下技术方案，包括以下步骤：

步骤(一)重组质粒pEGFP-IL-37-N1的构建：经过引物设计、扩增、酶切、琼脂糖凝胶电泳、胶回收、连接、转化、摇菌、质粒提取步骤得到pEGFP-IL-37-N1质粒；

步骤(二)重组痘苗病毒VV-IL-37/VV-IL-37-GFP的生成与包装：

(2.1)取处于对数生长期的293细胞，制备成细胞悬液，然后铺到细胞培养皿中，放入CO₂恒温细胞培养箱中培养；

(2.2)用无血清的DMEM细胞培养基配制野生型痘苗病毒工作液，随后，将病毒工作液加入293细胞中，并放于CO₂细胞培养箱孵育，使病毒吸附细胞；

(2.3)取1上述pEGFP-IL-37-N1质粒加到离心管中，再依次加入EC buffer和Enhancer buffer，轻轻混匀后，室温放置；

(2.4)向离心管中加入Effectene转染液，用移液枪轻轻吹打混匀后，室温放置；

(2.5)之后向离心管加入DMEM细胞培养基，轻轻混匀，即为质粒转染工作液；

(2.6)取出293细胞，弃掉上清，用PBS轻轻清洗三次，随后，加入质粒转染工作液，再添加DMEM细胞培养基，混匀后，放入CO₂细胞培养箱中培养；

(2.7)之后收集细胞上清液，放于离心机中离心1；离心完成后，用滤器过滤细胞上清液，随后，

(2.8)将细胞上清液移入超速离心管中，并置于超速离心机中离心；离心完成后，弃掉上清，加入病毒保存液，充分溶解，即为生成并包装好的重组痘苗病毒VV-IL-37/VV-IL-37-GFP。

优选地，步骤(1)中：根据GenBank中IL-37的序列分别设计用于上下游引物，并引入双酶切位点。

优选地，步骤(1)中扩增步骤为：以合成的IL-37cDNA为模板，用设计的IL-37特异性引物进行PCR及promega GoTaq DNA聚合酶进行PCR扩增。