[发明专利]新型重组痘苗病毒VV-IL-37的构建方法和应用

权利要求书

1.新型重组痘苗病毒VV-IL-37的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤(一)重组质粒pEGFP-IL-37-N1的构建：经过引物设计、扩增、酶切、琼脂糖凝胶电泳、胶回收、连接、转化、摇菌、质粒提取步骤得到pEGFP-IL-37-N1质粒；

步骤(二)重组痘苗病毒VV-IL-37/VV-IL-37-GFP的生成与包装：

(2.1)取处于对数生长期的293细胞，制备成细胞悬液，然后铺到细胞培养皿中，放入CO₂恒温细胞培养箱中培养；

(2.2)用无血清的DMEM细胞培养基配制野生型痘苗病毒工作液，随后，将病毒工作液加入293细胞中，并放于CO₂细胞培养箱孵育，使病毒吸附细胞；

(2.3)取1上述pEGFP-IL-37-N1质粒加到离心管中，再依次加入EC buffer和Enhancerbuffer，轻轻混匀后，室温放置；

(2.4)向离心管中加入Effectene转染液，用移液枪轻轻吹打混匀后，室温放置；

(2.5)之后向离心管加入DMEM细胞培养基，轻轻混匀，即为质粒转染工作液；

(2.6)取出293细胞，弃掉上清，用PBS轻轻清洗三次，随后，加入质粒转染工作液，再添加DMEM细胞培养基，混匀后，放入CO₂细胞培养箱中培养；

(2.7)之后收集细胞上清液，放于离心机中离心1；离心完成后，用滤器过滤细胞上清液，随后，

(2.8)将细胞上清液移入超速离心管中，并置于超速离心机中离心；离心完成后，弃掉上清，加入病毒保存液，充分溶解，即为生成并包装好的重组痘苗病毒VV-IL-37/VV-IL-37-GFP。

2.根据权利要求1所述的新型重组痘苗病毒VV-IL-37的构建方法，其特征在于：步骤(1)中：根据GenBank中IL-37的序列分别设计用于上下游引物，并引入双酶切位点。

3.根据权利要求1所述的新型重组痘苗病毒VV-IL-37的构建方法，其特征在于：步骤(1)中扩增步骤为：以合成的IL-37cDNA为模板，用设计的IL-37特异性引物进行PCR及promega GoTaq DNA聚合酶进行PCR扩增。

4.根据权利要求1所述的新型重组痘苗病毒VV-IL-37的构建方法，其特征在于：步骤(1)中酶切步骤为：用限制性内切酶EcoRI和BamH1分别对回收的PCR产物和pEGFP-N1空载体进行37℃双酶切过夜。

5.根据权利要求1所述的新型重组痘苗病毒VV-IL-37的构建方法，其特征在于：步骤(1)中转化步骤为：

(1)配制LB固体培养基，放入高压锅灭菌后室温静置2h；

(2)然后向配好的LB固体培养基中加入抗生素；

(3)将以前冻的感受态大肠杆菌DH5α放在冰上，使其慢慢恢复室温；

(4)加入100-200ng质粒，缓慢的用1mL移液枪吹打混匀，整个过程都要在冰上进行，继续孵育30min；

(5)提前打开水浴锅并将其设置为42℃，将上述孵育完毕的感受态大肠杆菌DH5α于42℃水浴锅中孵育90s后，依旧放回冰上冷却2min；

(6)向感受态大肠杆菌DH5α中加入DMEM培养基，打开恒温摇床，将其放在摇床上上孵育45min；

(7)将孵育结束的感受态大肠杆菌DH5α均匀的涂在LB培养基上，倒置于37℃细菌培养箱中过夜培养。