[发明专利]一种多基因串联法构建生物合成褪黑素大肠杆菌工程菌的方法及应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种多基因串联法构建生物合成褪黑素大肠杆菌工程菌的方法及应用。本发明提供了一种合成褪黑素的融合基因，对L‑色氨酸作为底物生物合成褪黑素途径的4个基因进行结构优化和化学合成，并创制了含有4个基因原核表达单元的大肠杆菌工程菌，最后通过RT‑PCR验证这4个外源基因在转录水平均进行了正确的表达，进一步通过摇瓶发酵实验来检验其生成褪黑素的能力，最终通过UHPLC‑MS/MS测得其褪黑素产量达到1mg/L。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种多基因串联法构建生物合成褪黑素大肠杆菌工程菌的方法及应用。

背景技术

褪黑素又名褪黑激素，是松果腺体分泌的特有神经类激素，是色胺衍生物系列里重要成员。它的药理和生理活性越来越多已被临床试验证明，在免疫力提高、改善睡眠、抗氧化和延缓衰老等方面有着不可替代的作用，是天然药物产物成分。在欧美等发达国家被誉为生命机体的黄金活性元素。化学合成法一直是生产褪黑素的主要方法，但其费用偏高且会造成环境污染。生物合成法具有方便、快捷、稳定、产物单一、环境友好等优点，被广泛用于生物制造。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多基因串联法构建生物合成褪黑素大肠杆菌工程菌的方法及应用，费用低、效率高、绿色环保。

本发明提供了一种合成褪黑素的融合基因，所述融合基因包括mXcP4H、HsAADC、HsAANAT和HIOMT基因。

优选的，所述mXcP4H基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，HsAADC基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，HsAANAT基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，HIOMT基因的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

优选的，所述融合基因的各组成基因在进行融合前，还包括进行密码子优化，经密码子优化后的mXcP4H基因(mXcP4HS)的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，优化后的HsAADC基因(HsAADCS)的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，优化后的HsAANAT基因(HsAANATS)的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，优化后的HIOMT基因(HIOMTS)的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

本发明还提供了一种包含上述融合基因的表达盒，将每个经密码子优化后的基因分别与T7启动子和终止子融合，构建四个基因表达盒；

所述的T7启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，所述T7终止子的核苷酸序列如SEQ ID No.10。

本发明还提供了一种包含上述表达盒的多基因表达盒。

优选的，所述多基因表达盒的连接顺序，从5’端至3’端为：mXcP4HS-mXcP4HS-HsAANATS-HIOMTS。

本发明还提供了一种包含上述多基因表达盒的重组载体。

优选的，所述多基因表达盒经EcoRI和HindIII双酶切后，连入相同酶切的载体pBR326(GenbankNo:Z052603)中，得重组载体(pBR7992)。

本发明还提供了一种包含上述重组载体的工程菌。

优选的，所述重组质粒转入到大肠杆菌BL21-AI(DE3)中，得到大肠杆菌工程菌株BL7992。

本发明还提供了一种从L-色氨酸合成褪黑素的大肠杆菌工程菌，在所述大肠杆菌工程菌的基因组中包含上述重组质粒。

本发明还提供了一种利用上述大肠杆菌工程菌合成褪黑素的方法，包括以下步骤：将所述大肠杆菌工程菌在增菌培养基中进行摇菌培养，得种子液；

将所述种子液接种到发酵培养基中进行发酵，发酵液中检测到褪黑素；

所述发酵时以L-色氨酸为发酵底物。