[发明专利]利用人类线粒体ND6基因重组载体制备ND6蛋白及应用

说明书

本发明公开了利用人类线粒体ND6基因重组载体制备ND6蛋白及应用。本载体通过全基因合成方法合成并优化核密码子编码的ND6核苷酸序列，构建人类ND6基因重构载体。人类ND6基因重组载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。本发明还公开了上述制备的ND6蛋白的氨基酸序列，线粒体靶向序列，CMV启动子序列，表达载体序列，包含ND6蛋白制备方法及所用制剂。本发明所述人类ND6基因重组载体能在细胞中高效表达，制备的ND6蛋白能靶向线粒体，发挥正常ND6蛋白功能，缓解m.14484TC突变导致的ND6蛋白异常对细胞功能造成的影响。

技术领域

本发明属于生物制剂领域，涉及利用人类线粒体ND6基因重组载体制备ND6蛋白及应用，所述应用是人类ND6基因重组载体在制备ND6蛋白试剂盒中的应用。

背景技术

Leber遗传性视神经病变(Leber hereditary optic neuropathy，LHON)是一种线粒体DNA(mtDNA)突变引起的视神经退行性线粒体遗传性疾病。早期可表现为视乳头周围微动脉血管改变，视网膜神经纤维层肿胀等。该疾病青年男性好发，发病年龄集中在20-30岁，多数患者出现双眼或先后无痛性视力减退，多数患者视力下降至0.1以下。

Leber遗传性视神经病变主要与NADH泛醌氧化还原酶三个线粒体基因之一的突变有关，分别为m.3460GA、m.11778GA、m.14484TC，其中14484位点突变导致线粒体呼吸链复合体Ⅰ的ND6氨基酸序列改变，复合体Ⅰ活性下降，视神经细胞氧化磷酸化过程受到影响，ATP产生降低，患者出现LHON疾病且预后不佳。

]LHON目前尚无有效的临床治疗手段，但随着基因治疗技术的进步，通过将重组腺相关病毒药剂注入眼玻璃体腔内感染视神经细胞，将外源野生型正常蛋白导入线粒体发挥作用，可达到治疗LHON的目的，但该技术还存在蛋白表达效率不高，细胞内表达靶向性较低等缺点，影响治疗效果，尚且有待改进。

发明内容

本发明的目的是提供利用人类线粒体ND6基因重组载体制备ND6蛋白，解决靶向人类线粒体的ND6蛋白表达量低，蛋白靶向性不高等技术问题。通过优化ND6基因序列和ND6蛋白制备体系，将人类ND6基因重组载体入细胞，编码正常ND6蛋白并定位至线粒体，进而缓解m.14484TC原发性突变导致的Leber遗传性视神经病变。

本发明的技术方案之一，是提供一种人类ND6基因重组载体，所述人类ND6基因重组载体的基因序列从N端到C端依次为CMV启动子，线粒体靶向序列COX8A-MTS和优化后的核密码子编码的人类ND6核苷酸序列。

优选的，所述核密码子编码的ND6蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

优选的，所述线粒体靶向序列COX8A-MTS如SEQ ID NO:2所示。

优选的，所述CMV启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的再一个目的是提供所述人类ND6基因重组载体在制备ND6蛋白试剂盒中的应用。人类ND6重组载体编码的ND6蛋白，必须准确靶向人类线粒体才能正确发挥功能，线粒体靶向序列Mitochondrial Targeting Signal(MTS)能将细胞内编码的ND6蛋白引导至线粒体，因此，所述核基因编码的ND6蛋白必须与线粒体靶向序列连接。

为解决上述问题，本发明的技术方案之一，是提供一种COX8A的MitochondrialTargeting Signal(MTS)作为特异性线粒体蛋白引导序列，使融合蛋白靶向性效果更好，能准确高效地将ND6导入线粒体，所述线粒体靶向序列COX8A-MTS如SEQ ID NO:2所示。

为解决上述问题，本发明的技术方案之一，是提供重组表达载体，所述重组表达载体包含ND6基因核苷酸优化序列，能导入细胞并正常表达靶向人类线粒体的ND6蛋白，所述载体为pAAV-ZsGreen，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。