[发明专利]一种广谱型H9亚型禽流感亚单位疫苗及其制备方法

说明书

本发明提供一种广谱型H9亚型禽流感亚单位疫苗及其制备方法，属于基因工程领域。该广谱型H9亚型禽流感亚单位疫苗中抗原为氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的蛋白。本发明广谱型H9亚型禽流感亚单位疫苗抗原能与H9亚型禽流感不同分支或亚分支病毒阳性血清发生特异性反应，免疫效力试验表明该抗原安全、无不良反应，可诱导机体产生较高抗体水平，可抵御多个分支或亚分支H9亚型禽流感病毒的攻击，显著抑制排毒，具有较好的免疫效果。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种广谱型H9亚型禽流感亚单位疫苗及其制备方法。

背景技术

H9N2禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)是危害我国养禽业发展的重要传染病。H9N2 AIV自1966年在美国威斯康星州首次发现以来在世界范围内广泛传播，1994年我国广东省首次分离到该病毒。流行病学研究表明自2016年以来H9N2 AIV感染比例逐渐增加，目前已成为我国禽流感中最主要亚型，在鸡、火鸡、水禽中感染严重，且幼禽的病毒分离率较高，尤其伴有继发感染时死亡率高达90％，给养禽业造成严重损失。最新抗原进化分析结果显示H9N2 AIV由h9.4.2.5等多个分支和亚分支组成，基因型呈现高度多样性，不同基因型间交叉保护较差。

防控H9亚型禽流感的主要手段依然是免疫接种。目前，国内外现有技术产品仅有基于单个流行毒株制备而成的灭活疫苗，其虽在一定程度上减少了H9N2给养禽业造成的经济损失，但无法阻止感染鸡排毒，亦无法对变异株提供有效保护；免疫鸡群常常分离到H9AIV，究其原因主要是疫苗抗原匹配不佳引发病毒抗原变异和免疫逃逸。然而，国内外尚无H9AIV广谱免疫防控技术及产品。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效、广谱型H9亚型禽流感亚单位疫苗，为H9亚型禽流感的防控提供更好的预防和控制效果。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种广谱型H9亚型禽流感亚单位疫苗，所述疫苗中抗原为氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示的蛋白。

在本发明中，通过培养携带所述蛋白编码基因的重组杆状病毒制备所述疫苗抗原。

优选的技术方案中，所述蛋白编码基因的序列如SEQ ID NO:4所示。

在本发明中，所述重组杆状病毒采用如下方法构建：在SEQ ID NO:4的5’端添加kozak序列，3’端添加Leu zip序列，然后插入杆状病毒转移载体pFastBac1中，得到重组杆状病毒转移质粒；将所述重组杆状病毒转移质粒转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，获得重组杆状病毒穿梭质粒；将所述重组杆状病毒穿梭质粒转染昆虫细胞Sf9，获得表达所述抗原的重组杆状病毒。

优选的技术方案中，采用High Five细胞培养所述重组杆状病毒。

优选的技术方案中，将所述抗原灭活，加入其体积4％的吐温-80，乳化，得到水相；将96体积份白油和4体积份司本-80混合均匀，得到油相；将水相和油相按照体积比1:3混合、乳化，得到所述疫苗。

优选的技术方案中，采用甲醛灭活所述抗原。

本发明H9亚型禽流感亚单位疫苗具有广谱性，能与H9亚型禽流感不同分支(h9.1分支A/Chicken/Heilongjiang/35/00(H9N2)、h9.4.2.3分支A/Chicken/Shandong/S/96(H9N2)、h9.4.2.5亚分支A/Chicken/Henan/01/2019(H9N2)、h9.4.2.5亚分支A/Chicken/Jilin/01/2019(H9N2)、h9.4.2.5亚分支A/Chicken/Liaoning/01/2015(H9N2))病毒阳性血清发生特异性交叉反应，免疫效力试验表明该抗原安全、无不良反应，可诱导机体产生较高的抗体水平，具有较好的免疫效果；攻毒保护试验表明该抗原免疫后诱导机体产生的抗体能高效抑制排毒。