[发明专利]一种测量单分子RNA力谱的方法及其应用

说明书

本发明提供了一种测量单分子RNA力谱的方法及其应用，所述方法包括以下步骤：1)获得手柄链：设计并合成带有特殊修饰的手柄链引物；根据手柄链引物获得带有特殊修饰的手柄链，所述手柄链包括手柄链1和手柄链2；所述手柄链1和手柄链2带有粘性末端；2)获得单分子RNA‑手柄复合链：获得单分子RNA，所述RNA带有与上述粘性末端互补配对的片段；将手柄链与RNA退火，得到单分子RNA‑手柄复合链。本方法可以快速高效精准的对单个RNA分子实施力谱测量。本方法制备的单分子RNA复合链可以承受更大的作用力，可以用于较高作用力的测量，也可用于RNA结构分析。

技术领域

本发明涉及一种测量单分子RNA力谱的方法及其应用，属于生物物理，结构生物学领域。

背景技术

RNA分子一直是生物学家关注的重要生物大分子，早期的研究认为RNA在中心法则中作为DNA和蛋白之间传递遗传信息的重要分子，但随后发现，大部分RNA并不会翻译成蛋白质，而是具有多种重要的生理功能，例如：遗传编码、基因表达、基因调控和酶催化功能等。从分子结构角度来讲，在这些功能中起作用的既可以是其一级序列，也可以是二级或三级结构。然而，研究人员对RNA的复杂结构并不十分了解，与DNA规则的双螺旋结构不同，RNA分子一般为单链核糖核酸通过碱基配对折叠成二级结构或更复杂的三级结构，并且，RNA分子常与其他分子(蛋白质、DNA/RNA、小分子等)相互作用，其构象往往会实时变化。例如，冠状病毒基因组为的单股正义RNA病毒，在开放阅读框1a的末端有一个假结结构，可使核糖体执行-1位移码，从而在开放阅读框1b上继续翻译更长的多肽1ab，目前普遍认为该移码行为与该处RNA分子构具有特殊的假结结构有关。

目前，大多数具备重要生物医学价值的RNA结构仍然未知，且很难通过序列信息准确地预测其结构及功能，需要通过不同的方法逐一解析结构和研究功能，例如：SHAPE、X射线、核磁共振和冷冻电子显微镜等技术。SHAPE技术使用亲电试剂与活性不同的2-羟基反应，通过反转录的方法解析RNA分子的结构，该方法已经成功用于多种重要RNA的结构分析，但是，此方法主要获取RNA二级结构，信息较为单一。X射线技术和冷冻电子显微镜方法较为复杂，难以广泛应用，而核磁共振技术对RNA大小具有较大的限制，很难检测较大RNA分子(60nt)。

光镊技术(Optical Tweezer)也称为梯度力光阱技术，使用聚焦的激光对物体产生力的作用，自光镊技术提出以来，其在生物领域中的应用就受到了广泛的关注，Ashkin也因此在2018年被授予诺贝尔物理学奖。与其他单分子力谱技术相比，光镊技术拥有更高的空间(亚纳米)、力学(亚皮牛顿)、时间(亚毫秒)分辨率，其特点与RNA分子的长度(单核苷酸长度约为0.59nm)、力学(0-30pN)等固有特性一致。随着光镊技术的发展，双光阱光镊技术逐渐成熟，与传统单分子力谱技术(单光阱光镊，磁镊，原子力显微镜)将待研究分子的一端固定于玻璃、基底或探针表面不同，双光阱光镊技术将待研究分子固定于悬浮微球之间，并且使用压电平台、雪崩光电二极管等先进器件，大大降低外界环境带来的影响，提高技术的分辨率和稳定性。目前，单分子力谱技术已经较为广泛地应用于DNA、蛋白质的力谱研究，技术较为成熟，然而由于RNA分子不稳定和结构较为复杂，其力谱实验方法建立较为困难，缺少单分子RNA力谱的研究。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种测量单分子RNA力谱的方法及其应用。

一方面，本发明提供一种测量单分子RNA力谱的方法，所述方法包括：

1)获得手柄链：设计并合成带有特殊修饰的手柄链引物；根据手柄链引物获得带有特殊修饰的手柄链，所述手柄链包括手柄链1和手柄链2；所述手柄链1和手柄链2带有粘性末端；优选地，所述手柄链为带有粘性末端的双链DNA；优选地，所述粘性末端长度为30-100nt，更优选为30-50nt；

2)获得单分子RNA-手柄复合链：获得单分子RNA，所述RNA带有与上述粘性末端互补配对的片段；将手柄链与RNA退火，得到单分子RNA-手柄复合链。