[发明专利]一种测量单分子RNA力谱的方法及其应用

权利要求书

1.一种测量单分子RNA力谱的方法，所述方法包括：

1)获得手柄链：设计并合成带有特殊修饰的手柄链引物；根据手柄链引物获得带有特殊修饰的手柄链，所述手柄链包括手柄链1和手柄链2；所述手柄链1和手柄链2带有粘性末端；

2)获得单分子RNA-手柄复合链：获得单分子RNA，所述RNA带有与上述粘性末端互补配对的片段；将手柄链与RNA退火，得到单分子RNA-手柄复合链。

2.根据权利要求1所述的测量单分子RNA力谱的方法，其中，所述方法还包括获得标准双链DNA；所述标准双链DNA是以手柄链引物为扩增引物进行扩增得到的；

优选地，所述标准双链DNA是以手柄链1的上游引物和手柄链2的下游引物为扩增引物进行扩增得到的。

3.根据权利要求1或2所述的测量单分子RNA力谱的方法，其中，所述引物和/或手柄链带有1个或2个以上的特殊修饰分子；

优选地，所述引物和/或手柄链带有3个、4个或5个以上的特殊修饰分子。

4.根据权利要求1-3任一项所述的测量单分子RNA力谱的方法，其中，所述特殊修饰包括地高辛修饰、生物素修饰、d-spacer修饰、Phosphate修饰、Thiophosphate修饰和叠氮基团修饰中的一种或两种以上的组合。

5.根据权利要求1-4任一项所述的测量单分子RNA力谱的方法，其中，所述引物和/或手柄链带有3个以上的地高辛修饰；

优选地，所述手柄链带有3-5个地高辛修饰。

6.根据权利要求1-5任一项所述的测量单分子RNA力谱的方法，其中，所述手柄链分别带有特殊修饰和粘性末端；

优选地，所述手柄链1分别带有特殊修饰和长度为30-100nt的粘性末端1；

优选地，所述手柄链2分别带有特殊修饰和长度为30-100nt的粘性末端2；

优选地，所述粘性末端1包括如SEQ ID NO.7所示序列的片段；

优选地，所述粘性末端2包括如SEQ ID NO.8所示序列的片段。

7.根据权利要求1-6任一项所述的测量单分子RNA力谱的方法，其中，所述方法包括通过改变上、下游引物的间隔距离得到不同长度的手柄链和/或标准双链DNA；

优选地，可以通过改变质粒大小改变手柄链和/或标准双链DNA的长度；

优选地，可以通过改变引物在模板上的结合位置改变手柄链和/或标准双链DNA的长度。

8.根据权利要求1-7任一项所述的测量单分子RNA力谱的方法，优选地，所述手柄链引物包括如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4所示序列的引物。

9.根据权利要求1-8任一项所述的测量单分子RNA力谱的方法，其中，所述退火是将待研究RNA分子与手柄链1和手柄链2按摩尔比(0.7-2):1:1混合后退火；

优选地，所述退火是将待研究RNA分子与手柄链1和手柄链2按摩尔比1:1:1混合后退火。

10.根据权利要求1-9任一项所述的测量单分子RNA力谱的方法，其中，所述退火的温度为50-65℃；

优选地，所述退火的温度为62℃和/或52℃；

进一步优选地，所述退火的条件为：98℃10分钟，62℃1小时，52℃1小时，4℃终止反应。

11.根据权利要求1-10任一项所述的测量单分子RNA力谱的方法，其中，所述退火的缓冲液为含有甲酰胺和PIPES的缓冲溶液；

优选地，所述退火的缓冲液中含有体积分数为60％-80％的甲酰胺；

进一步优选地，所述退火的缓冲液为含有：体积分数为80％的甲酰胺、400mM NaCl、40mM PIPES和1mM EDTA的pH 7.5的溶液。