[发明专利]一种检测靶核酸的方法和试剂盒

说明书

本公开提供了一种检测靶核酸的方法和试剂盒，通过采用含有封闭基团的引物，提高靶核酸扩增的特异性和准确度，进一步结合连接有不同检测信号基团的探针，完成熔解曲线，实现不同靶核酸在不同检测信号通道检测，进一步提高了检测通量，从而实现了高通量、高灵敏度和高准确度检测靶核酸。

技术领域

本公开属于核酸检测领域，具体涉及一种检测靶核酸的方法和试剂盒。

背景技术

天性耳聋导致的原因有：遗传、药物、感染、疾病、环境噪声污染及意外事故等，其中遗传因素导致的听力丧失占了50％以上。遗传性听力丧失根据是否伴有耳外组织的异常或病变可将其分为综合征性听力丧失(syndromic hearing loss，SHL)和非综合征性听力丧失(nonsyndromic hearing loss，NSHL)，其中NSHL占70％以上。NSHL根据遗传方式可分为：常染色体隐形遗传性耳聋、常染色体显性遗传性耳聋、X连锁遗传性耳聋、Y连锁遗传性耳聋和线粒体遗传性耳聋，其中75％-80％为常染色体隐形遗传，10-20％为常染色体显性遗传，X连锁和线粒体遗传不到2％。迄今为止，158个非综合征性耳聋位点已定位，包括57个常染色体显性位点、77个常染色体隐性位点、7个X染色体连锁位点、2个修饰位点、1个Y染色体位点和14个线粒体位点。通过位置克隆的方法已确定53个致病基因，包括27个常染色体隐性基因、21个常染色体显性基因、1个X染色体连锁基因和4个线粒体基因。在这些基因中GJB2、SLC26A4和线粒体12S rRNA基因的研究比较深入，不同人群存在不同的突变形式和突变频率，是我国最主要的致聋基因。新生儿耳聋基因检测辅助诊断先天性耳聋和遗传性耳聋。

目前对于多重基因检测，常见的技术主要包括基因芯片技术、荧光定量PCR技术、高通量测序技术及熔解曲线技术。基因芯片技术通量较高，但其存在着优化困难、易污染、灵敏度低、仪器不普及等缺点；荧光定量PCR技术是目前较为常见的技术，该技术在检测位点少时有着明显优势，但在检测位点多时通量低的缺点就暴露出来；高通量测序技术，通量高信息丰富，但其高额成本及较长的检测时间制约该技术的普及。熔解曲线技术与荧光定量PCR技术类似，非常节省标本，但是通量不高仍是目前最大的缺点。

因此，如果低成本、高通量地检测目标基因，例如高通量地检测耳聋基因，将在众多多重基因检测方法中显示出明显优势。

发明内容

本公开的目的在于提供一种能够高通量检测目标基因的方法，能够实现高灵敏度和准确度地检测包括耳聋基因等的目标基因。

本公开为解决上述技术问题，提出了如下技术方案：

本公开第一方面提供了一种检测靶核酸的方法，其包括：

(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含：(i)包含或怀疑包含所述靶核酸的核酸样品；(ii)至少一组引物对，其中每组引物对中的至少一个引物与所述靶核酸的一部分互补，并且每组引物对包含至少一个封闭引物，所述封闭引物包含能够阻断聚合酶延伸的封闭基团；(iii)至少一条探针，所述探针部分或全部与所述靶核酸互补，所述探针上连接有检测信号基团，(iv)核酸聚合酶，和(v)去封闭剂，所述去封闭剂能够使所述靶核酸通过所述封闭引物由所述核酸聚合酶进行聚合；

(b)在用于扩增所述靶核酸的条件下孵育所述反应混合物；

(c)对步骤(b)孵育结束的反应混合物在对应检测信号通道进行熔解曲线分析。

本公开第二方面提供了一种用于检测靶核酸的试剂盒，其包括：(i)至少一组引物对，其中每组引物对中的至少一个引物与所述靶核酸的一部分互补，并且每组引物对包含至少一个封闭引物，所述封闭引物包含能够阻断聚合酶延伸的封闭基团；(ii)至少一条探针，所述探针部分或全部与所述靶核酸互补，所述探针上连接有检测信号基团，和(iii)去封闭剂，所述去封闭剂能够使所述靶核酸通过所述封闭引物由所述核酸聚合酶进行聚合；以及任选地(iv)核酸聚合酶。