[发明专利]一种检测靶核酸的方法和试剂盒

权利要求书

1.检测靶核酸的方法，其包括：

(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含：(i)包含或怀疑包含所述靶核酸的核酸样品；(ii)至少一组引物对，其中每组引物对中的至少一个引物与所述靶核酸的一部分互补，并且每组引物对包含至少一个封闭引物，所述封闭引物包含能够阻断聚合酶延伸的封闭基团；(iii)至少一条探针，所述探针部分或全部与所述靶核酸互补，所述探针上连接有检测信号基团，(iv)核酸聚合酶，和(v)去封闭剂，所述去封闭剂能够使所述靶核酸通过所述封闭引物由所述核酸聚合酶进行聚合；

(b)在用于扩增所述靶核酸的条件下孵育所述反应混合物；

(c)对步骤(b)孵育结束的反应混合物在对应检测信号通道进行熔解曲线分析；

优选地，所述靶核酸为单链DNA或双链DNA；

优选地，所述靶核酸的种类至少为1、2、5、10、15或20种。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述封闭基团位于每个封闭引物的3'末端处或其附近；优选地，所述封闭基团是2',3'-双脱氧核苷酸、核糖核苷酸残基、2',3'SH核苷酸或2'-O-PO₃核苷酸；

优选地，所述封闭引物被进一步修饰以减少不需要的核酸的扩增；优选地，所述修饰是在所述引物中引入至少一个错配的核苷酸；优选地，所述错配的核苷酸与具有所述封闭基团的核苷酸相距2-18bp；优选地，所述错配的核苷酸与具有所述封闭基团的核苷酸相距3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17bp；优选地，所述错配的核苷酸碱基位于具有所述封闭基团的核苷酸的5'侧；

优选地，所述修饰是这样的修饰：其用以提升所述封闭引物和所述靶核酸之间的Tm；优选地，所述修饰是这样的修饰：其用以形成额外桥，所述额外桥连接所述封闭引物的至少一个核苷酸的2'氧和4'碳。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物包含至少5、10或20组引物对；优选10-50组。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述引物中的每一个的长度各自为8至100个核苷酸；优选地，8至80个核苷酸；优选地，8至60个核苷酸；优选地，8至40个核苷酸；优选地，8至20个核苷酸。

5.根据权利要求1所述的方法，其中在任何两个引物之间存在不超过20个互补的核苷酸配对和不超过50％的序列互补性；优选地，在任两组引物对的任何两个引物之间存在不超过19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个互补的核苷酸配对。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述去封闭剂选自CS5 DNA聚合酶、具有F667Y突变的ampliTaq或KlenTaq聚合酶、焦磷酸盐或RNase H2，所述CS5 DNA聚合酶具有选自G46E、L329A、Q601R、D640G、I669F、S671F、E678G的突变或这些突变的组合。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针的3’端一侧的末端碱基上连接淬灭基团，探针的5’端一侧的末端碱基上连接荧光基团；优选地，所述淬灭基团和荧光基团各自独立地通过化学键、连接基团或1-3个核苷酸构成的接头与碱基连接；优选地，所述荧光基团选自FAM、VIC、JOE、NED、TET、HEX、TAMRA、ROX、TEXASRED、CY3、CY5、CY5.5或CY7；优选地，所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl、MGB或TAMARA；优选地，所述反应混合物包含1-20条探针；优选10-20条。