[发明专利]一种长效人重组胰高血糖素样肽-1及其应用

说明书

本发明提出了一种长效人重组胰高血糖素样肽‑1及其应用，将野生型GLP‑1进行变异改造，使其不被DPP‑4酶剪切，将包含一个或多个CTP的序列连接到变异型GLP‑1的N端或/和C端；所述的GLP‑1野生型的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述的GLP‑1变异型的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述的CTP的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。开发一种长效人胰高血糖素样肽‑1，通过HCGβ羧基末端肽（CTP）的序列连接到突变型胰高血糖素样肽‑1的编码序列的手段。通过将一个或多个CTP序列连接到GLP‑1的C端或/和N端来设计类似物。

技术领域

本发明涉及一种长效人重组胰高血糖素样肽-1及其应用，属于基因构建技术领域。

背景技术

胰高血糖素样肽-1 (GLP-1) 是一种由 30 或 31个氨基酸组成的肽激素，源自胰高血糖素原肽的组织特异性翻译后加工。它由肠内分泌L细胞和孤束核内的某些神经元在食物消耗后产生和分泌。初始产物 GLP-1 (1-37) 易被酰胺化和蛋白水解裂解，从而产生两种截短且等效的生物活性形式，GLP-1 (7-36) 酰胺和 GLP-1 (7-37)。活性 GLP-1 由两个α-螺旋组成，分别位于氨基酸的13-20位和24-35位，被一个连接区隔开。

GLP-1一旦分泌，会对蛋白水解酶二肽基肽酶4 (DPP-4)的催化活性极为敏感。具体来说，DPP-4 可以裂解GLP-1 Ala⁸-Glu⁹ 之间的肽键，导致形成丰富的 GLP-1 (9-36) 酰胺，其在循环中总 GLP-1 的占比可达 60-80%。DPP-4 在多种组织和细胞类型中广泛表达，并以膜锚定和可溶性循环形式存在。更值得注意的是，DPP-4 在内皮细胞表面表达，包括与GLP-1 分泌位点直接相邻的细胞。

GLP-1 具有多种生理特性，使其（及其功能类似物）成为深入研究的主题，其可作为糖尿病潜在的治疗方法，可以使糖尿病病情得到长期改善并具有直接的效果。它具有通过增强胰岛素分泌以葡萄糖依赖性方式降低血糖水平的能力。除了促胰岛素作用外，GLP-1还与许多调节和保护作用有关。与 GIP（抑胃肽） 不同，GLP-1 的作用在Ⅱ型糖尿病患者中得以保留，因此大量药物研究已针对开发基于 GLP-1 的治疗。

内源性 GLP-1 主要被DPP-4以及中性内肽酶和肾脏清除迅速降解，半衰期约为2分钟。因此，只有10-15%的GLP-1完好无损地进入循环，导致空腹血浆水平仅为0-15 pmol/L。为了克服这个问题，已经开发了 GLP-1 受体激动剂和 DPP-4 抑制剂来增加 GLP-1 活性。与胰岛素和磺脲类等常见治疗药物相反，基于 GLP-1 的治疗与体重减轻和低血糖风险降低有关，这是 Ⅱ 型糖尿病患者的两个重要考虑因素。

GLP-1 最值得注意的作用是其以葡萄糖依赖性方式促进胰岛素分泌的能力。由于GLP-1 与胰腺 β 细胞上表达的 GLP-1 受体结合，受体与 G 蛋白亚基偶联并激活腺苷酸环化酶，从而增加 ATP 生成 cAMP。随后，包括 PKA 和 Epac2 在内的二级通路的激活改变了离子通道活性，导致细胞溶质Ca²⁺水平升高，从而增强了胰岛素颗粒的胞吐作用。在此过程中，葡萄糖的流入可确保有足够的ATP 来维持刺激作用。

本发明通过对野生型GLP-1进行变异改造和连接人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽（CTP）来设计新的长效 GLP-1 变体。先前已批准将 CTP 连接到蛋白质的编码序列导致体内半衰期增加。此外，CTP显示在人类中不具有免疫原性。

发明内容