[发明专利]一种长效人重组胰高血糖素样肽-1及其应用

权利要求书

1.一种长效人重组胰高血糖素样肽-1，其特征在于：将野生型GLP-1进行变异改造，使其不被DPP-4酶剪切，将包含一个或多个CTP的序列连接到变异型GLP-1的N端或/和C端；

所述的GLP-1野生型的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述的GLP-1变异型的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述的CTP的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.一种基于权利要求1所述的长效人重组胰高血糖素样肽-1的制备方法，其特征在于：具体方法为：使用基因合成技术构造变异型人胰高血糖素样肽-1（GLP-1）的嵌合基因含有HCGβ羧基末端肽（CTP）的序列，其中CTP可以Ⅰ）一个在C端；Ⅱ）一个在N端；Ⅲ）两个在C端；Ⅳ) 两个在N端；Ⅴ）两个其中一个在N端，另外一个在C端；Ⅵ）三个在C端；Ⅶ）三个在N端；Ⅷ）三个其中一个在N端，另外两个在C端；Ⅸ）三个其中两个在N端，另外一个在C端，这些嵌合基因将被测序并克隆到真核表达载体中，将构建的含有GLP-1和CTP序列的载体转染到CHO细胞中，然后选择稳定的克隆，收集稳定克隆的培养基，纯化GLP-1 变体。

3.根据权利要求2所述的一种长效人重组胰高血糖素样肽-1的制备方法，其特征在于，所述变异型嵌合基因的构建包括如下步骤：（S1）构建GLP-1-CTP；（S2）构建GLP-1-CTP-CTP；（S3）构建GLP-1-CTP-CTP-CTP；（S4）构建CTP-GLP-1；（S5）构建CTP-CTP-GLP-1；（S6）构建CTP-CTP-CTP-GLP-1；（S7）构建CTP-GLP-1-CTP；（S8）构建CTP-GLP-1-CTP-CTP；（S9）构建CTP-CTP-GLP-1-CTP。

4.根据权利要求3所述一种长效人重组胰高血糖素样肽-1的制备方法，其特征在于：所述的步骤（S1）包括如下步骤：所述的GLP-1-CTP是HCGβ序列和GLP-1序列的基因被用作模板，其构建方法分三步进行：（1）引物1和引物2以HCGβ基因作为模板，引物1包含GLP-1序列的后4个基码和CTP 5′端序列的前4个基码，引物2包含CTP 3′端序列的后4个基码和一个限制位点的反义基码；

（2）引物3和引物4以GLP-1基因作为模板，引物3包含GLP-1 序列的前4个基码和一个限制位点，引物4包含GLP-1序列的后4个基码和CTP 5′端序列的前4个基码的反义基码；

（3）以（1）和（2）反应的基因产物用作引物2和引物3的模板，用于放大GLP-1-CTP；

所述的步骤（S2）包括如下步骤：所述的GLP-1-CTP-CTP是HCGβ序列和GLP-1-CTP序列的基因被用作模板，其构建方法分三步进行：（1）引物1和引物2以HCGβ基因作为模板，引物1包含CTP 3′端序列后4个基码和CTP 5′端序列的前4个基码，引物2包含CTP 3′端序列的后4个基码和一个限制位点的反义基码；（2）引物3和引物4以GLP-1-CTP基因作为模板，引物3包含GLP-1 序列的前4个基码和一个限制位点，引物4包含CTP 3′端序列后4个基码和CTP 5′端序列的前4个基码的反义基码；（3）以（1）和（2）反应的基因产物用作引物2和引物3的模板，用于放大GLP-1-CTP-CTP；

所述的步骤（S3）包括如下步骤：所述的GLP-1-CTP-CTP-CTP是HCGβ序列和GLP-1-CTP-CTP序列的基因被用作模板，其构建方法分三步进行：（1）引物1和引物2以HCGβ基因作为模板，引物1包含CTP 3′端序列后4个基码和CTP 5′端序列的前4个基码，引物2包含CTP 3′端序列的后4个基码和一个限制位点的反义基码；（2）引物3和引物4以GLP-1-CTP-CTP基因作为模板，引物3包含GLP-1序列的前4个基码和一个限制位点，引物4包含CTP 3′端序列的后4个基码和CTP 5′端序列的前4个基码的反义基码；（3）以（1）和（2）反应的基因产物用作引物2和引物3的模板，用于放大GLP-1-CTP-CTP-CTP。