[发明专利]一种活体无损伤提取贝类高质量DNA的方法及其应用

说明书

本发明提供了一种活体无损伤提取贝类高质量DNA的方法，包括S1：壳皮采集、S2：壳皮清洗、S3：DNA提取：取壳皮组织置于研钵中，加入液氮研磨至粉状，转移至离心管中；加入STE裂解缓冲液，再加入SDS溶液和蛋白酶K，充分混匀，置于恒温水浴锅中消化过夜，直至裂解液澄清；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀、抽提后多次离心处理，取上清液，加入NaAc，无水乙醇，缓慢摇匀，置于‑20℃冰箱中以进行沉淀；离心后得到DNA沉淀；弃去上清，用乙醇溶液洗涤所述步骤S33得到的沉淀；之后离心并弃去上清液，将得到的DNA沉淀在通风橱中进行干燥处理溶解后得到所述DNA。本发明提供了一种操作便捷处理简单的贝类高质量DNA提取方法，具有较高的商业化价值与推广价值。

技术领域

本发明涉及贝类DNA提取技术领域，具体而言，涉及一种活体无损伤提取贝类高质量DNA的方法及其应用。

背景技术

DNA作为遗传信息的载体和最基本的遗传物质，在遗传变异、分子调控等方面发挥着重要作用，是分子生物学和基因工程研究的主要对象。随着分子生物学技术的发展，群体遗传学和分子标记辅助育种技术已广泛应用到重要经济贝类遗传育种研究中，而提取高质量的DNA是进行贝类分子遗传学研究的前提。然而，贝类DNA的提取一般需要鲜活组织样品，即需将贝类活体打开贝壳、壳上钻孔甚至杀死个体等取其部分软体部组织用于DNA提取，该方法对个体损害极大，往往造成较强的机械损伤或致死，不利于贝类种质资源保存、遗传育种，尤其是对珍稀贝类的研究工作。在贝类中，关于非致死取样进行DNA提取已有相关报道。

包振民等公布了发明专利(CN103320425A，2013.09.25)“一种用于大规模、高通量基因分型的贝类DNA快速提取方法”，通过取用少量鳃丝组织进行DNA提取，对贝类生存、生长、发育等影响很小，建立了一种适用于大量或珍贵样本的快速有效非致死性的DNA提取方法。董志国等公布了发明专利(CN110592071A，2019.12.20)“一种从贝类排泄物中提取贝类DNA的方法”，通过收集贝类排泄物进行DNA提取，建立了一种对贝类无刺激无损伤的技术方法，利于贝类后期保种、遗传育种及种质资源保护，尤其对濒危珍稀贝类。《中国海洋大学学报》2020年7月，第50卷增刊I，张凤梅等所著“双壳类软体动物贝壳DNA高效提取及方法学评价”，通过对栉孔扇贝、虾夷扇贝、长牡蛎和侏儒蛤4种贝类贝壳的DNA提取和评价实验，提出了一种适用于双壳类软体动物贝壳DNA的提取方法，为活体或软体组织取样困难的贝类开展遗传和进化分析提供了技术手段。

上述方法虽然各有优点，但也都存在明显的不足，如活体开壳取鳃丝或外套膜组织，对贝类有一定刺激，且不适用于蛏类或单壳类等不能开壳的贝类；贝类排泄物提取法，存在排泄物搜集困难、提取的DNA有一定降解等问题；而贝壳中提取DNA的方法，贝壳需进行脱钙、研磨，操作较繁琐，而且损伤贝壳也会造成活体伤害。因此探索活体无损伤提取贝类高质量DNA的方法意义重大。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种活体无损伤提取贝类高质量DNA的方法，以解决目前常规方法操作困难，对活体伤害大的问题。

为解决上述问题，本发明提供了一种活体无损伤提取贝类高质量DNA的方法，包括以下步骤：

S1：壳皮采集：将健康无病、活力好的待检贝类活体清洗解剖后得到条状和/或块状壳皮；

S2：壳皮清洗：将所述步骤S1得到的壳皮放入离心管中，加水并进行震荡；然后将所述壳皮转移到另一离心管中，重复上述步骤，从而除去壳皮表面的污物、细菌；

S3：DNA提取：包括，

S31：取壳皮组织置于研钵中，加入液氮研磨至粉状，转移至离心管中；加入STE裂解缓冲液，再加入SDS溶液和蛋白酶K，充分混匀，置于恒温水浴锅中消化过夜，直至裂解液澄清；

S32：加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀、抽提后离心处理；取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，混匀、抽提10min，12000rpm离心10min；