[发明专利]一种活体无损伤提取贝类高质量DNA的方法及其应用

权利要求书

1.一种活体无损伤提取贝类高质量DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：壳皮采集：将健康无病、活力好的待检贝类活体清洗解剖后得到条状和/或块状壳皮；

S2：壳皮清洗：将所述步骤S1得到的壳皮放入离心管中，加水并进行震荡；然后将所述壳皮转移到另一离心管中，重复上述步骤，从而除去壳皮表面的污物、细菌；

S3：DNA提取：包括：

S31：取壳皮组织置于研钵中，加入液氮研磨至粉状，转移至离心管中；加入STE裂解缓冲液，再加入SDS溶液和蛋白酶K，充分混匀，置于恒温水浴锅中消化过夜，直至裂解液澄清；

S32：加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀、抽提后离心处理；取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，混匀、抽提10min，12000rpm离心10min；

S33：取上清液，加入NaAc，无水乙醇，缓慢摇匀，置于-20℃冰箱中以进行沉淀；离心后得到DNA沉淀；

S34：弃去上清，用乙醇溶液洗涤所述步骤S33得到的沉淀；之后离心并弃去上清液，将得到的DNA沉淀在通风橱中进行干燥处理，加入灭菌双蒸水溶解DNA沉淀得到DNA溶液，完成提取。

2.根据权利要求1所述的活体无损伤提取贝类高质量DNA的方法，其特征在于：所述步骤S34完成提取后还包括步骤S35：取步骤S4制备得到的DNA溶液进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，其余置于-20℃冰箱保存备用。

3.根据权利要求1所述的活体无损伤提取贝类高质量DNA的方法，其特征在于：所述步骤S1中，所述清洗解剖包括：将待检贝类活体放置于解剖盘中，用软毛刷蘸蒸馏水充分清洗壳表的污物，用解剖刀沿着壳口平行方向轻切壳边缘的新鲜壳皮，然后用镊子撕下条状和/或块状壳皮。

4.根据权利要求1所述的活体无损伤提取贝类高质量DNA的方法，其特征在于：所述步骤S2中，所述震荡为间歇震荡，且所述震荡的时间为1-2min。

5.根据权利要求1所述的活体无损伤提取贝类高质量DNA的方法，其特征在于：所述步骤S31中，所述SDS溶液的浓度为10％，所述蛋白酶K的浓度为20mg/mL。

6.根据权利要求1所述的活体无损伤提取贝类高质量DNA的方法，其特征在于：所述步骤S32中，所述混匀、抽提后离心处理包括：混匀、抽提10min后继续以12000rpm的速度离心10min；且所述混匀、抽提后离心处理的次数为4次。

7.根据权利要求1所述的活体无损伤提取贝类高质量DNA的方法，其特征在于：所述步骤S33中，所述离心的条件为在4℃，以13000rpm的速度离心10min。

8.根据权利要求1所述的活体无损伤提取贝类高质量DNA的方法，其特征在于：所述步骤S34中，所述乙醇溶液的浓度为70％，所述离心的条件为：在4℃，以10000rpm的速度离心2min，且所述离心并弃去上清液的次数为2次。

9.根据权利要求1所述的活体无损伤提取贝类高质量DNA的方法，其特征在于：所述步骤S34中，所述干燥处理的条件为：将DNA沉淀置于通风橱中吹3-5min至干燥。

10.一种权利要求1-9任一项所述活体无损伤提取贝类高质量DNA的方法的应用，其特征在于：所述应用包括将所述方法应用在缢蛏毛蚶焦河蓝蛤管角螺的DNA提取上。