[发明专利]一种天瓜内生菌转化生产葫芦素E的方法

说明书

本发明公开了一种天瓜内生菌转化生产葫芦素E的方法，属于微生物技术领域。由天瓜瓜蒂提取物制备、固体培养基的配制、液体培养基的配制、天瓜内生菌F1的培养及葫芦素E葡萄糖苷转化步骤完成，最终得到稀有葫芦素E。本发明从天瓜瓜蒂中提取总葫芦素，经天瓜内生菌转化生产稀有葫芦素E，其中的葫芦素E葡萄糖苷转化率达58‑73％，葫芦素E的含量可提高1.5‑3.2倍。本发明采用天瓜内生菌转化生产稀有葫芦素E，内生菌生长周期短、生长迅速，易于培养而不受环境因素影响，适宜工业化生产。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种天瓜内生菌转化生产葫芦素E的方法。

背景技术

天瓜是指葫芦科西瓜属带有苦味的西瓜品种,如药西瓜拉丁名(Citrulluscolocynthis)。原产于地中海地区,在我国主要分布在新疆等地,是维吾尔族习用药材,收载于我国一九九八年卫生部颁药材标准维吾尔分册中。天瓜味苦，性寒，入脾、胃经，主要适用于由寒气所引起的各种疾病,缓解疼痛,通气,消肿止痛。

天瓜果实和根中含有多种葫芦素成分,其中以葫芦素及其单葡萄糖苷含量最高。葫芦素是一类高度氧化的葫芦烷型四环三萜烯类物质，至今已发现40多种，其中以葫芦素B和E应用最广。葫芦素E具有抗肿瘤、抗化学致癌、增强机体免疫力的作用，目前临床用于慢性肝炎和原发性肝癌的辅助治疗。

甜瓜蒂提取的总葫芦素中存在葫芦素E的糖苷，其含量接近甚至大于葫芦素E的含量，但生物活性远远不如葫芦素E。天瓜提取物中活性成分大多为糖苷键连接的化合物，由于人体缺乏相应的酶，不能将其水解为苷元进而吸收利用。因此，为了提高天瓜的食用和药用价值，需要开发一条生物转化葫芦素E葡萄糖苷制备葫芦素E的工艺具有潜在的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种天瓜内生菌转化生产葫芦素E的方法。

为实现上述目的，本发明提供的一种天瓜内生菌转化生产葫芦素E的方法包括以下步骤：

1.天瓜瓜蒂提取物制备

取天瓜瓜蒂于80℃烘干12h，粉碎后过100目筛，加入20-50倍量(m/V)的70％乙醇，40℃水浴浸提2.5h，再超声提取0.5h，离心取上清液，上清液减压蒸干后用5-10倍量(m/V)的甲醇溶解，经孔径0.22μm有机滤膜过滤，得到天瓜瓜蒂提取物。

2.固体培养基的配制

取土豆200g切成块放入锅中，加水至1000mL，在加热器上加热至沸腾，维持30min，过滤，弃滤渣。滤液中加入蔗糖20g，碳酸钙2-4g及琼脂粉15-20g，补足水至1000mL，121℃高压蒸汽灭菌20min得到固体培养基。

3.液体培养基的配制

配制葡萄糖1％、豆粕0.5％、酵母提取物0.5％、氯化钠0.5％、磷酸氢二钾0.5％的培养基，向其中加入碳酸钙2-4g，补足水至1000mL，得到液体培养基。

4.天瓜内生菌F1的培养

取天瓜内生菌打成菌饼块，所述的天瓜内生菌为腐皮镰孢菌(Fusarium solani(Mart.))，将菌饼接种于固体培养基平板的中心，28℃培养，6-9天后刮取平板上的菌丝移到100mL液体培养基的三角瓶中，28℃、120r/min往复摇床培养8-10天，得到天瓜内生菌F1的培养液。

5.葫芦素E葡萄糖苷转化方法

向含有天瓜内生菌F1的培养液的三角瓶中加入已灭菌的玻璃珠，再将该三角瓶放在摇床中，180rpm室温振荡1-2h，在无菌环境下过滤菌液，此菌液含有孢子；先将含有孢子的菌液按上述振荡条件下培养24h后，加入天瓜瓜蒂提取物，最后使天瓜内生菌F1菌液的孢子最终浓度为3-5×10⁶CFU/mL，继续振荡培养1-2天，得到稀有葫芦素E。

本发明的最佳方法如下：