[发明专利]一种天瓜内生菌转化生产葫芦素E的方法

权利要求书

1.一种天瓜内生菌转化生产葫芦素E的方法，其特征在于由以下步骤现实：

(1)天瓜瓜蒂提取物制备

取天瓜瓜蒂于80℃烘干12h，粉碎后过100目筛，加入20-50倍量(m/V)的70％乙醇，40℃水浴浸提2.5h，再超声提取0.5h，离心取上清液，上清液减压蒸干后用5-10倍量(m/V)的甲醇溶解，经孔径0.22μm有机滤膜过滤，得到天瓜瓜蒂提取物；

(2)固体培养基的配制

取土豆200g切成块放入锅中，加水至1000mL，在加热器上加热至沸腾，维持30min，过滤，弃滤渣。滤液中加入蔗糖20g，碳酸钙2-4g及琼脂粉15-20g，补足水至1000mL，121℃高压蒸汽灭菌20min得到固体培养基；

(3)液体培养基的配制

配制葡萄糖1％、豆粕0.5％、酵母提取物0.5％、氯化钠0.5％、磷酸氢二钾0.5％的培养基，向其中加入碳酸钙2-4g，补足水至1000mL，得到液体培养基；

(4)天瓜内生菌F1的培养

取天瓜内生菌打成菌饼块，所述的天瓜内生菌为腐皮镰孢菌(Fusarium solani(Mart.))，将菌饼接种于固体培养基平板的中心，28℃培养，6-9天后刮取平板上的菌丝移到100mL液体培养基的三角瓶中，28℃、120r/min往复摇床培养8-10天，得到天瓜内生菌F1的培养液；

(5)葫芦素E葡萄糖苷转化方法

向含有天瓜内生菌F1的培养液的三角瓶中加入已灭菌的玻璃珠，再将该三角瓶放在摇床中，180rpm室温振荡1-2h，在无菌环境下过滤菌液，此菌液含有孢子；先将含有孢子的菌液按上述振荡条件下培养24h后，加入天瓜瓜蒂提取物，最后使天瓜内生菌F1菌液的孢子最终浓度为3-5×10⁶CFU/mL，继续振荡培养1-2天，得到稀有葫芦素E。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于由以下步骤现实：

(1)天瓜瓜蒂提取物制备

取天瓜瓜蒂于80℃烘干12h，粉碎后过100目筛，加入20倍量(m/V)的70％乙醇，40℃水浴浸提2.5h，再超声提取0.5h，离心取上清液，上清液减压蒸干后用5倍量(m/V)的甲醇溶解，经孔径0.22μm有机滤膜过滤，得到天瓜瓜蒂提取物；

(2)固体培养基的配制

取土豆200g切成块放入锅中，加水至1000mL，在加热器上加热至沸腾，维持30min，过滤，弃滤渣。滤液中加入蔗糖20g，碳酸钙2g及琼脂粉18g，补足水至1000mL，121℃高压蒸汽灭菌20min得到固体培养基；

(3)液体培养基的配制

配制葡萄糖1％、豆粕0.5％、酵母提取物0.5％、氯化钠0.5％、磷酸氢二钾0.5％的培养基，向其中加入碳酸钙2g，补足水至1000mL，得到液体培养基；

(4)天瓜内生菌F1的培养

取天瓜内生菌打成菌饼块，所述的天瓜内生菌为腐皮镰孢菌(Fusarium solani(Mart.))，将菌饼接种于固体培养基平板的中心，28℃培养，6天后刮取平板上的菌丝移到100mL液体培养基的三角瓶中，28℃、120r/min往复摇床培养8天，得到天瓜内生菌F1的培养液；

(5)葫芦素E葡萄糖苷转化方法

向含有天瓜内生菌F1的培养液的三角瓶中加入已灭菌的玻璃珠，再将该三角瓶放在摇床中，180rpm室温振荡1h，在无菌环境下过滤菌液，此菌液含有孢子；先将含有孢子的菌液按上述振荡条件下培养24h后，加入天瓜瓜蒂提取物，最后使天瓜内生菌F1菌液的孢子最终浓度为3-5×10⁶CFU/mL，继续振荡培养1天，得到稀有葫芦素E。