[发明专利]一种鉴别蟾酥的分子生物学方法及其应用

说明书

本发明公开了一种快速鉴别不同种的蟾酥的分子生物学方法，该方法按下述步骤进行：(1)称取适量的干品蟾酥，置于器皿中研磨粉碎，采用基因组DNA提取试剂盒提取不同种蟾酥的总DNA；(2)利用DNA条形码引物扩增线粒体COI基因5′端序列作为标记；以及(3)进行蟾酥基原鉴别的序列特征比对。该方法能对中华蟾酥、黑眶蟾酥和/或东北蟾酥进行种间鉴定以及对商品蟾酥进行真伪鉴别，具有迅速、便捷的特点，且比传统的性状鉴别、理化鉴别更准确可靠。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种鉴别蟾酥的分子生物学方法及其应用。

背景技术

蟾酥来源于蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor和黑眶蟾蜍Bufo melanostictus Schneider的干燥分泌物。辛、温，有毒，归心经，具有解毒，止痛，开窍醒神之功效，用于痈疽疔疮，咽喉肿痛，中暑神昏，痧胀腹痛吐泻。现代药理研究表明，其具有抗肿瘤、强心、抑菌、抗炎、免疫调节、镇痛等药理活性。

然而，受到蟾蜍资源短缺、现代采集加工方式、地方用药习惯等多种因素的影响，当前市场中商品蟾酥基原混杂，非法定品种蟾酥入药较为普遍。根据当前动物分类学，中华蟾蜍Bufo gargarizans Cantor属于两栖纲无尾目Anura前凹型亚目Procoela蟾蜍科Bufonidae蟾蜍属Bufo动物，其下分为3个亚种：中华蟾蜍指名亚种B.gargarizansgargarizans Cantor、中华蟾蜍华西亚种B.gargarizans andrewsi Schmidt、中华蟾蜍岷山亚种B.gargarizans minshanicus Stejneger。对比药典来源项，发现存在以下问题：(1)中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor与动物分类学不一致，未明确种级还是亚种级入药；《中国药用动物志》记载中华蟾蜍B.gargarizans三个亚种均可入药。有研究者建议将药典来源项下“中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor”改为“中华蟾蜍Bufogargarizans Cantor”，然各亚种蟾酥质量的等同性需要进一步深究。(2)按照当前蟾蜍科分类，黑眶蟾蜍与中华蟾蜍亲缘关系较远，同时其化学组成与中华蟾酥差异较大，按照《中国药典》2020年版蟾酥含量限度来看，黑眶蟾酥难以达到要求，故其与中华蟾酥同等入药的合理性值得商榷。(3)最近有学者基于线粒体基因CR-ND2和核基因POMC-RAG-1-Rho进行系统发育学分析，建议将分布在东亚北部(包括中国东北地区)的中华蟾蜍进化支提升至种水平，命名为东北蟾蜍Bufo sachalinensis，来源于此种蟾蜍的蟾酥(东北蟾酥)与法定基原种中华蟾酥和黑眶蟾酥的差异性如何有待揭示。

综合以上考虑，有必要建立蟾酥的基原鉴别方法，为进一步明确法定基原蟾酥与近缘品蟾酥、及各亚种蟾酥间的品质差异，拓展蟾酥药用资源奠定基础。蟾酥作为分泌型动物药的典型代表，经加工后缺乏其原本基原动物的形态特征，而同属近缘物种的化学成分相近且易受到产地、加工、炮制过程的影响，故以性状鉴别、化学鉴别等方法明确蟾酥基原有一定局限性。DNA作为遗传信息的载体具有一定的种内稳定性和种间多样性，不会受到生长发育阶段、环境条件以及人类活动等外在因素的影响，在物种鉴定方面有明显的优势。当前已有多种DNA分子鉴定技术被应用于中药近缘混伪品鉴别及多基原鉴定，例如DNA条形码技术、特异PCR技术等。细胞色素c氧化酶I(COI)基因的5′端序列由于通用引物的可获得性和高进化速率已被作为动物界通用条形码序列，用于系统发育分析及物种鉴定。

本发明基于DNA条形码技术，建立一种快速鉴别不同种的蟾酥的分子生物学方法，用于中华蟾酥、黑眶蟾酥和东北蟾酥的鉴别，在鉴别蟾酥药材的真伪方面具有极强的应用价值。

发明内容

基于此，本发明提供了一种快速鉴别不同种的蟾酥的分子生物学方法，该方法按下述步骤进行：

(1)称取适量的干品蟾酥，置于器皿中研磨粉碎，采用基因组DNA提取试剂盒提取不同种蟾酥的总DNA；