[发明专利]一种鉴别蟾酥的分子生物学方法及其应用在审
| 申请号： | 202211167752.8 | 申请日： | 2022-09-23 |
| 公开（公告）号： | CN115851970A | 公开（公告）日： | 2023-03-28 |
| 发明（设计）人： | 高慧敏;孙伟;陈两绵;孟祥霄;王玉秀;王智民;马悦 | 申请（专利权）人： | 中国中医科学院中药研究所 |
| 主分类号： | C12Q1/6888 | 分类号： | C12Q1/6888;C12Q1/6858 |
| 代理公司： | 北京乾成律师事务所 11949 | 代理人： | 郑希元 |
| 地址： | 100700 北*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 鉴别 蟾酥 分子生物学 方法 及其 应用 | ||
1.一种快速鉴别不同种的蟾酥的分子生物学方法，其特征在于，所述方法按下述步骤进行：
(1)称取适量的干品蟾酥，置于器皿中研磨粉碎，采用基因组DNA提取试剂盒提取不同种蟾酥的总DNA；
(2)利用DNA条形码引物扩增线粒体COI基因5′端序列作为标记；以及
(3)进行蟾酥基原鉴别的序列特征比对。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述干品蟾酥由鲜品蟾酥经50℃～70℃烘干制成。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述器皿为离心管。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，使用高通量组织研磨仪研磨粉碎；
优选地，所述高通量组织研磨仪的频率为50～70Hz例如约60Hz；
优选地，所述高通量组织研磨仪的时间为1～5min例如约3min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)的扩增中，所使用的正向引物(Chmf4)如SEQ ID NO:1所示，反向引物(Chmr4)如SEQ ID NO:2所示。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，PCR反应体系为20μl，其中模板1μL，PCR预混合溶液10μL，正向引物COIF 1μL，反向引物COIR 1μL，ddH2O 7μL；
优选地，所述模板的加入量﹥50ng；
优选地，所述正向引物COIF和反向引物COIR的浓度为10μmol/L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，PCR反应条件如下：95℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，46℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃终延伸10分钟。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，采用1.0％琼脂糖凝胶电泳(140V，15min)进行PCR扩增产物检测，使用ABI3730XL测序仪进行Sanger测序；
优选地，在所述Sanger测序中，所使用的正向引物(COI-C01)如SEQ ID NO:3所示，反向引物(COI-C03)如SEQ ID NO:4所示。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，按下表所示的核苷酸序列特征变异位点进行蟾酥种间鉴别，
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优选地，所述蟾酥种间鉴别为中华蟾酥、黑眶蟾酥和/或东北蟾酥之间的种间鉴别；
更优选地，通过系统发育树构建进行蟾酥种间鉴别；
又优选地，基于K2P模型进行种内种间遗传距离计算，通过NJ系统发育树构建进行蟾酥种间鉴别。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法在快速鉴别不同种的蟾酥以及商品蟾酥真伪鉴别方面的用途。
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