[发明专利]一种快速酶解及富集磷酸化多肽的方法

说明书

本发明所示的一种快速酶解及富集磷酸化多肽的方法，包括以下步骤：先对蛋白样品还原烷基化使蛋白样品变性，再向已经变性的蛋白样品中加入SP3重悬液及Sera‑Mag Beads以便于分离和富集，然后进行酶解得到多肽，最后通过富集柱富集磷酸化多肽。本发明采用Single‑pot，Solid‑phase‑enhancedSample‑preparation(简写为SP3)重悬液与Sera‑mag Beads技术，可以促进蛋白质快速酶解，提高了蛋白的酶解效率，并对IMAC富集技术进行优化，提升了磷酸化多肽的富集效率，有利于磷酸化富集的大规模进行。

技术领域

本发明涉及一种快速酶解及富集磷酸化多肽的方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

蛋白质磷酸化是生物界中最为普遍也是非常重要的一种蛋白质修饰类型，在细胞内，大约有三分之一的蛋白质被认为有磷酸化修饰，蛋白质的磷酸化修饰几乎调节着生命活动的整个过程，包括DNA损伤修复、转录调节、信号转导、细胞凋亡的调节等。磷酸化蛋白质及多肽的研究可帮助我们阐明上述过程的机理，进一步理解生命系统如何在分子水平进行调控，从而认识生命的本质，在对磷酸化蛋白质或者多肽进行研究前必须先对研究对象进行富集，以提高研究的准确性。因此对蛋白质样品进行磷酸化富集是必经之路。

由于磷酸化多肽富集需要10-15mg蛋白酶解产物，现有技术常常采用多次酶解的方法进行，但是酶解效率低，副产物较多，不利于磷酸化多肽富集步骤的展开，导致了磷酸化多肽富集效率的低下。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速酶解及富集磷酸化多肽的方法，可以促进蛋白质快速酶解，提升磷酸化多肽的富集效率，有利于磷酸化富集的大规模进行。为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种快速酶解及富集磷酸化多肽的方法，包括以下步骤：先对蛋白样品还原烷基化使蛋白样品变性，再向已经变性的蛋白样品中加入SP3重悬液及Sera-Mag Beads以便于分离和富集，然后进行酶解得到多肽，最后通过富集柱富集磷酸化多肽。

进一步地，包括以下详细步骤：

S1、使蛋白样品变性：取蛋白样品，先加入1M二硫苏糖醇溶液，得到蛋白样品浓度为10mM的溶液，混匀后在37℃孵育60-90min，再加入1M碘乙酰胺溶液，得到蛋白样品浓度为25mM的溶液，混匀后室温避光反应20-40min，再次加入1M二硫苏糖醇溶液，得到蛋白样品浓度为10mM的溶液，室温下反应5-15min；

S2、加入SP3重悬液及Sera-Mag Beads：取S1反应后的溶液，先加入SP3重悬液，且加入所述SP3重悬液的体积不少于溶液的体积，混匀，再按照蛋白样品：Sera-Mag Beads＝1:10的质量比例加入Sera-Mag Beads，得到溶液a，然后加入与所述溶液a等体积的无水乙醇，用移液枪吹打混匀，放入恒温混匀仪，转速800-1000rpm，在室温25℃下，混匀5-15min，降速离心后将得到的沉淀物a用乙醇进行清洗操作；

S3、酶解：取S2清洗后的沉淀物a，先加入25mM NH₄HCO₃溶液，得到样品浓度为1mM的溶液，再按蛋白样品：胰蛋白酶＝1:50的质量比例添加胰蛋白酶，用恒温混匀仪800-1000rpm混匀，37℃消化过夜，然后使用16000-18000g离心5-10min，置于磁力架上，完全吸附后取上清液a，将所述上清液a冷冻干燥，得到干燥品a；

S4、将S3得到的干燥品a加入200ul的洗脱液，涡旋混匀，使多肽重悬；

S5、通过富集柱富集磷酸化多肽：先平衡富集柱，然后取S4已重悬的溶液200ul加入到富集柱中，拧紧盖子；轻微振荡富集柱底部5-15s，混匀，室温孵育20-50min，多次重复振荡-混匀的操作；然后使用900-1200g离心20-40s，除去经富集柱流下来的液体，得到沉淀物b；