[发明专利]一种快速酶解及富集磷酸化多肽的方法

权利要求书

1.一种快速酶解及富集磷酸化多肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：先对蛋白样品还原烷基化使蛋白样品变性，再向已经变性的蛋白样品中加入SP3重悬液及Sera-MagBeads以便于分离和富集，然后进行酶解得到多肽，最后通过富集柱富集磷酸化多肽。

2.如权利要求1所述的一种快速酶解及富集磷酸化多肽的方法，其特征在于，包括以下详细步骤：

S1、使蛋白样品变性：取蛋白样品，先加入1M二硫苏糖醇溶液，得到蛋白样品浓度为10mM的溶液，混匀后在37℃孵育60-90min，再加入1M碘乙酰胺溶液，得到蛋白样品浓度为25mM的溶液，混匀后室温避光反应20-40min，再次加入1M二硫苏糖醇溶液，得到蛋白样品浓度为10mM的溶液，室温下反应5-15min；

S2、加入SP3重悬液及Sera-Mag Beads：取S1反应后的溶液，先加入SP3重悬液，且加入所述SP3重悬液的体积不少于溶液的体积，混匀，再按照蛋白样品：Sera-Mag Beads＝1:10的质量比例加入Sera-Mag Beads，得到溶液a，然后加入与所述溶液a等体积的无水乙醇，用移液枪吹打混匀，放入恒温混匀仪，转速800-1000rpm，在室温25℃下，混匀5-15min，降速离心后将得到的沉淀物a用乙醇进行清洗操作；

S3、酶解：取S2清洗后的沉淀物a，先加入25mM NH₄HCO₃溶液，得到样品浓度为1mM的溶液，再按蛋白样品：胰蛋白酶＝1:50的质量比例添加胰蛋白酶，用恒温混匀仪800-1000rpm混匀，37℃消化过夜，然后使用16000-18000g离心5-10min，置于磁力架上，完全吸附后取上清液a，将所述上清液a冷冻干燥，得到干燥品a；

S4、将S3得到的干燥品a加入200ul的洗脱液，涡旋混匀，使多肽重悬；

S5、通过富集柱富集磷酸化多肽：先平衡富集柱，然后取S4已重悬的溶液200ul加入到富集柱中，拧紧盖子；轻微振荡富集柱底部5-15s，混匀，室温孵育20-50min，多次重复振荡-混匀的操作；然后使用900-1200g离心20-40s，除去经富集柱流下来的液体，得到沉淀物b；

S6、对S5得到的沉淀物b进行洗涤，更换新的收集管，加入100ul的洗脱液，使用900-1200g离心20-40s，再次加入100ul的洗脱液，且使用900-1200g离心20-40s，收集离心后的洗脱液，合并洗脱液并进行冷冻干燥，得到干燥品b，即完成磷酸化多肽的收集；

S7、将S6得到的干燥品b用含0.1％FA的溶液溶解，高速离心取上清液b，取1ug所述上清液b用LC-MS进行质谱分析，以检测富集后的磷酸化多肽。

3.如权利要求2所述的一种快速酶解及富集磷酸化多肽的方法，其特征在于，步骤S2中所述SP3重悬液的组成为50mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，1％十二烷基硫酸钠，1％聚乙二醇辛基苯基醚，1％吐温20，1％乙基苯基聚乙二醇，5mM乙二胺四乙酸，50mM氯化钠，1％的丙三醇，1×蛋白酶抑制剂和5mM二硫苏糖醇。

4.如权利要求2所述的一种快速酶解及富集磷酸化多肽的方法，其特征在于，步骤S2中清洗的详细步骤为：加入180ul 80％乙醇，用移液枪吹打混匀，再放入磁力架吸附，重复2-4次。

5.如权利要求2所述的一种快速酶解及富集磷酸化多肽的方法，其特征在于，步骤S2中Sera-Mag Beads为两种Beads的等体积混合物，两种Beads分别为Sera-Mag magneticcarboxylate和Sera-Mag Speed Beads carboxylate。

6.如权利要求2所述的一种快速酶解及富集磷酸化多肽的方法，其特征在于，步骤S4中还包括检测已重悬溶液的PH值，若PH＞3，则加入适量100％TFA溶液，调节PH值至PH＜3。