[发明专利]类风湿关节炎全转录组m6A甲基化修饰差异表达的综合分析方法

说明书

本发明涉及一种类风湿关节炎全转录组m6A甲基化修饰差异表达的综合分析方法。本发明采用高通量测序结合甲基化RNA免疫沉淀和RNA测序获得RA患者滑膜的全转录组m6A修饰，并进一步对下游信号通路进行富集。发现RA滑膜中有2025个转录本存在差异甲基化位点，其中1016个peaks显著上调，1009个peaks显著下调；通过m6A‑seq和RNA‑seq的联合分析显示，共有120个基因在m6A修饰和mRNA表达上都有显着变化；GO和KEGG分析表明，差异表达的m6A基因与巨噬细胞活化参与的免疫反应、血管内皮、MAPK信号通路、PI3K‑Akt信号等炎症过程密切相关。

技术领域

本发明属于风湿免疫病分子生物学领域，具体涉及一种类风湿关节炎全转录组m6A甲基化修饰差异表达的综合分析方法，具体而言，本发明具体涉及全转录组m6A甲基化修饰差异表达基因在研究类风湿关节炎疾病进展、发病机制的应用。

背景技术

类风湿关节炎(RA)是一种由免疫介导的以滑膜受累为主的慢性疾病。具体发病机制目前尚不完全清楚，免疫力、生活方式、遗传和环境因素都与其有关。但各因素之间的相互作用如何在RA发病中发挥作用尚无很好解释。RA发病机制的不明确为精准的早期诊断与治疗带来了困难，因次探索RA发病机制的研究方法迫在眉睫。

表观遗传因素可能成为链接遗传学和基因表达的重要媒介，用于解释RA发病原因。观遗传学的作用，特别是RNA修饰在关节炎中的作用引起极大的关注。近年来，越来越多的研究开始关注表观遗传学在RA发病中的作用。表观遗传学调控在不改变任何DNA序列前提下，使基因功能发生可遗传变化，最终导致疾病表型发生改变，包括RNA甲基化、DNA甲基化、共价组蛋白修饰等。已经证明DNA和组蛋白的表观遗传修饰参与了类风湿关节炎的发病机制，但探讨是否涉及RNA中N6-甲基腺苷(m6A)的修饰研究较少。

m6A甲基化通过控制基因表达在各种生物过程中发挥重要作用，包括免疫识别、先天和适应性免疫反应的激活，对免疫、病毒感染和自身炎症性疾病的重要调节作用。m6A甲基化修饰参与对类风湿关节炎疾病的过程，在RA疾病进展、治疗和预后扮演着重要角色。从m6A角度探索RA全转录组的差异表达基因并研究其作用，全面了解参与RA发病的m6A修饰mRNAs有助于理解表观遗传学在RA中的作用，并有助于寻找新的治疗靶点。

发明内容

针对目前对RA发病机制缺乏RNA中m6A的修饰研究，本发明提供了一种类风湿关节炎全转录组m6A甲基化修饰差异表达的综合分析方法，具体如下：

①、RNA的提取步骤：

1)收集滑膜组织，加入1ml TRIzol裂解；

2)裂解完全后，加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置5分钟；

3)4℃12000rpm离心10分钟，取上清加入到另一EP管中；

4)加入0.5mL预冷的异丙醇，温和混匀，-20℃孵育30分钟；

5)4℃12000rpm离心15分钟，弃去上清；

6)加入1mL预冷的75℅乙醇，无水乙醇用DEPC水稀释；4℃12000rpm离心5分钟，弃上清；

7)重复步骤6)；

8)室温干燥RNA沉淀，加入20-50μL DEPC水，-80℃保存备用；

②、总RNA质量检测

(1)准备100ml DEPC水，用来稀释RNA的浓度和清洗比色杯；

(2)准备滤纸片和滤纸条，用来吸取比色杯里残留的液体；

(3)取出样品放入冰盒，吸取100μl的DEPC水，放入测定仪器中，按下空白键键，调零；