[发明专利]类风湿关节炎全转录组m6A甲基化修饰差异表达的综合分析方法

权利要求书

1.类风湿关节炎全转录组m6A甲基化修饰差异表达的综合分析方法，其特征在于，步骤如下：

①、RNA的提取步骤：

1)收集滑膜组织，加入1ml TRIzol裂解；

2)裂解完全后，加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置5分钟；

3)4℃12000rpm离心10分钟，取上清加入到另一EP管中；

4)加入0.5mL预冷的异丙醇，温和混匀，-20℃孵育30分钟；

5)4℃12000rpm离心15分钟，弃去上清；

6)加入1mL预冷的75℅乙醇，无水乙醇用DEPC水稀释；4℃12000rpm离心5分钟，弃上清；

7)重复步骤6)；

8)室温干燥RNA沉淀，加入20-50μL DEPC水，-80℃保存备用；

②、总RNA质量检测

(1)准备100ml DEPC水，用来稀释RNA的浓度和清洗比色杯；

(2)准备滤纸片和滤纸条，用来吸取比色杯里残留的液体；

(3)取出样品放入冰盒，吸取100μl的DEPC水，放入测定仪器中，按下空白键键，调零；

(4)吸取1μl的样品，再用100μl的枪头反复吸取，以将样品和水充分混匀；

(5)测定浓度，记下数据(R值：OD260/280，OD260/230浓度)；

(6)1.8R2.0时，说明总RNA质量符合要求；

③、rRNA去除，RNA纯化及片段化

取适量总RNA从中去除rRNA，利用带有针对特定物种的rRNA探针与总RNA孵育，捕获其中的rRNA，探针上带有生物素修饰，用包被了链霉亲和素的磁珠与探针和rRNA复合物结合，去除rRNA；再经过一次MagicPure RNA Beads磁珠纯化，得到去除了rRNA的RNA，包括带polyA和不带polyA的mRNA，非编码RNA和调控RNA；rRNA-removal在金属离子存在条件下片段化，得到长度范围为60-200bp的RNA片段；保留1/10体积的RNA作为Input，其他RNA进行下一步抗体免疫沉淀；

④、抗体免疫沉淀

预先混合Dynabeads Protein A磁珠和抗体，4℃旋转孵育2h得到磁珠和抗体的复合物；向上述磁珠-抗体溶液中加入片段化的RNA，4℃旋转孵育2h，使带有m6A甲基化修饰的RNA片段与抗体结合；用磁力架分离磁珠和溶液，去掉溶液，加入wash buffer重悬磁珠，充分洗涤3-5次，去除与磁珠非特异性结合的RNA片段，提高实验结果的灵敏性；向去除非特异性结合RNA的磁珠中加入含有m6A的洗脱液，竞争性洗脱特异性结合的含有m6A修饰的RNA片段，标记为IP；

⑤、链特异性文库构建

1)逆转录合成一链cDNA

以IP和Input RNA为模板，在一链合成缓冲液和Invitrogen逆转录酶SuperScript IV的作用下进行第一链cDNA的合成；同时在一链合成缓冲液添加了放线菌素D，防止依赖DNA模板的错误逆转录，保证以RNA为模板的逆转录特异性；

2)合成第二链cDNA

向合成一链cDNA的体系中加入二链合成预混体系，反应首先水解消化RNA/cDNA杂合链上的RNA，然后DNA聚合酶以一链cDNA为模板，以用dUTP替换了dTTP的dNTP Mix为底物，合成带有dUTP的二链cDNA；由于后续PCR放大步骤中，高保真聚合酶不能识别和扩增随机掺入dUTP的第二链cDNA，从而只放大来源于一链cDNA的文库信息，实现链特异性文库的构建；经过一次MagicPure DNA Beads II磁珠纯化，最终得到可直接在两端加“A”的双链cDNA；

3)3’末端加“A”反应

向上述体系中加入3’末端加“A”缓冲反应体系；在末端修饰完成的双链cDNA两边3’末端加上单个腺苷酸“A”，防止cDNA片段之间的平末端自连，而可以与下一步测序接头5’末端的单个“T”突出互补配对，准确连接，有效降低文库片段之间自身的串联；

4)连接测序接头

向上述反应体系中加入连接缓冲液和双链测序接头，利用T4 DNA连接酶将illumina测序接头连接至文库DNA两端；30℃孵育10分钟，快速有效的进行连接反应；

5)文库片段筛选

对于加上接头的文库，应用MagicPure DNA Beads II核酸片段筛选试剂盒在纯化文库的同时，进行片段大小筛选；采用两步法筛选，先用SPRI磁珠去掉目标区域左侧小片段，再去掉位于目标片段区域右侧的大片段，最终筛选出片段峰值在250bp的原始文库，用于下一步的PCR扩增；经过纯化后的文库，去掉了体系中过量的测序接头，和接头自连的产物，避免PCR放大过程的无效扩增，消除对上机测序的影响；

6)PCR扩增cDNA文库

在50μL反应体系中应用高保真的聚合酶放大原始文库，以保证上测序仪的足够文库总量；只有两端都带上接头的DNA片段能够被扩增，去除掉只连接单端接头的片段，使合格文库得到富集；同时因为新生的二链cDNA上带有dUTP，阻碍了高保真聚合酶以此为模板的扩增，使得放大文库只来源于一链cDNA，链方向信息被忠实保留；PCR扩增循环数控制在12-15之间；在保证产物足够的前提下，减少因扩增循环数过大而引入的偏差；放大后的文库经过磁珠纯化即成为可以上机的测序文库；

7)文库质量检测

对构建好的测序文库进行质检和定量；应用Qubit准确定量文库浓度，应用Agilent2100 Bioanalyzer确定文库片段大小分布，评估是否适合上机；

8)上机测序

对于质检合格的样品经过稀释后，根据不同样品测序通量要求，按相应摩尔比例对多个样品进行混样上机；采用Illumina高通量测序平台，2×150bp双端测序策略对文库进行测序；

⑥、数据分析

1)mRNA原始数据质量评估

2)测序数据量统计

3)原始数据碱基质量分布

4)原始数据过滤

5)参考基因比对

6)mRNA的定量表达

7)mRNA的差异表达分析

8)差异表达基因的富集分析

9)甲基化位点预测

10)甲基化位点差异分析

11)甲基化差异位点基因富集分析

12)甲基化差异位点基因与差异表达基因的联合分析。