[发明专利]一种丽花石山苣苔的组织培养方法

说明书

本发明涉及一种丽花石山苣苔的组织培养方法，涉及农业生物技术中植物组织培养领域，包括如下步骤：1)诱导不定芽培养，2)继代增殖培养，3)生根培养，4)炼苗移栽。通过诱导不定芽培养、继代增殖培养、生根培养、炼苗移栽过程成功获得了离体再生植株，建立起了组织培养快速繁殖技术体系，对于进行丽花石山苣苔优良种质资源的保护、快速繁殖和大面积推广、促进丽花石山苣苔的解濒和产业化发展具有重要意义。

技术领域

本发明涉及农业生物技术中植物组织培养领域，具体涉及一种广西喀斯特特有的濒危极小种群植物-丽花石山苣苔的组织培养方法。

背景技术

苦苣苔科石山苣苔属植物绝大部分都是适应于喀斯特岩溶地貌上的草本植物。丽花石山苣苔(Petrocodon pulchriflorus Y.B.LuQ.Zhang)为多年生草本植物，具粗而短根状茎；叶为稍长圆形或心状卵圆形；聚伞花序，每花序具6至14花，花朵为鲜艳的紫红色，中间部分具有鲜亮的明黄色花眼；花序梗长达20厘米；株型紧凑，花色艳丽，叶片青翠，具有极高的科研价值和室内盆栽花卉开发潜力，应用前景广阔。

丽花石山苣苔目前已知仅一个种群，属于极小种群植物，且仅见分布于我国广西天等县的一座石灰岩山山脚陡崖阴处，是广西和我国的特有种。2017年该正式发表以来，由于其极高的观赏价值，被当地居民大量采集出售，目前野外种群不足50个成熟个体，目前根据国际自然保护同盟的IUCN濒危等级评估体系被评“极危(Critically Endangered,CR)”。由于种源数量稀少，进一步限制了其在园林园艺实践中的有效应用。目前，丽花石山苣苔的种苗来源主要通过叶插进行繁育。由于该物种在自然条件下结实率极低，人工栽培条件下需要进行人工授粉获取种子，程序复杂且结实率仍然受到限。同时，播种虽然可在短时间内获得大量幼苗，然而经种子繁育的后代易发生性状分离，遗传性状不稳定，易丢失亲本的优良性状，并且长势不一，较难得到长势一致的群体后代；另外，这一物种的种子也不耐贮藏，一年后种子活力就下降50％，随着贮藏时间延长，种子萌发率越来越低。而叶插方式繁育需要大量的生长健康的叶片，成本高，耗时较长，且不同个体的叶插后代长势也很难保持一致，且存在周期长、成本高、效率低下、长势不一等问题，且对其的组织培养未见报道。因此，采用植物组织培养技术来缓解其种苗紧张压力、进行可持续开发利用是十分必要的。

由于丽花石山苣苔发表于2017年，关于其组织培养方面的研究，国内外目前尚无报道。叶片作为再生及遗传转化的外植体有其优势，取材方便、操作容易、来源广泛，有利于再生及遗传转化的重复进行等。因此，本发明以丽花石山苣苔无菌苗嫩叶为外植体，通过不定芽诱导、增殖、生根、炼苗移栽等过程成功获得了丽花石山苣苔离体再植株，建立其组织培养快速繁殖技术体系，对于进行这一物种的快速繁殖、大面积生产栽培和进行生态回归、促进丽花石山苣苔及其近缘物种的产业化发展具有重要意义。

目前石山苣苔属已经报道的组织培养和快速繁殖的未见报道，因此对特有分布于我国华南地区广西壮族自治区的石山苣苔属植物的相关研究有很强的理论价值和实践意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种丽花石山苣苔的组织培养方法。目的是为了在短期内提供大量的丽花石山苣苔种苗解决极度濒危现状以及高效开发利用这一野生花卉资源，本发明以丽花石山苣苔叶柄为外植体，通过诱导不定芽培养、继代增殖培养、生根培养、炼苗移栽过程成功获得了离体再生植株，建立起了组织培养快速繁殖技术体系，对于进行丽花石山苣苔优良种质资源的保护、快速繁殖和大面积推广、促进丽花石山苣苔的解濒和产业化发展具有重要意义。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种丽花石山苣苔的组织培养方法，包括如下步骤：1)诱导不定芽培养，2)继代增殖培养，3)生根培养，4)炼苗移栽；

所述步骤1)的诱导不定芽培养基为：MS基础培养基、1～2mg/L TDZ(脱叶灵，N-苯基-N'-(1,2,3-噻二唑-5-基)脲)、0.1～0.5mg/L KT(激动素)、0.05～0.2mg/L NAA(萘乙酸)、15～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8；