[发明专利]高效生物合成苯丙酮酸及4-羟基苯丙酮酸衍生物的方法

说明书

本发明公开了高效生物合成苯丙酮酸衍生物的方法，涉及的苯丙酮酸衍生物包括苯甲醇、苯乙醇、尿黑酸和酪醇。合成三种产物的途径包含多种酶：分支酸变位酶(pheA)，4‑羟基扁桃酸合酶(hmaS)，S‑扁桃酸脱氢酶(mdlB)，苯甲酰甲酸脱羧酶(mdlC)，氨基酸脱羧酶(aro10)，乙醇脱氢酶(adh6)，4‑羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)，和解除反馈抑制的预苯酸脱氢酶(tyrA^fbr)。首先以苯丙酮酸作为终产物对野生大肠杆菌进行改造，通过阻断竞争途径(苯丙氨酸、酪氨酸合成途径)和调整中心碳代谢构建了高产苯丙酮酸的宿主，然后将三种产物的合成途径导入宿主，实现了三种苯丙酮酸衍生物以葡萄糖为碳源的高效从头生物合成。本发明极具工业生产前景。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，更确切的说，本发明涉及高效生物合成苯丙酮酸及4-羟基苯丙酮酸衍生物的方法。

背景技术

苯丙酮酸和4-羟基苯丙酮酸是用途很广泛α-酮酸，在食品、农业和制药行业有非常广泛的应用，可以作为生产抗艾滋病、抗肿瘤、抗糖尿病以及肽类抗生素等药物的原料。苯丙酮酸和4-羟基苯丙酮酸的衍生物在药物和化工领域具有非常重要的应用价值。

苯甲醇是一种天然存在且结构最简单的芳香醇，被广泛的应用于食品、化工、医药等领域，目前市场价格为1.4-1.75万元/t。苯甲醇因为具有较低的挥发性以及较强的极性，被广泛的应用于生产胶水、油墨、树脂和油漆等材料。同时，因为苯甲醇具有怡人的芳香味，所以它被广泛的用于合成具有多种风味和香味的酯类产品，如香精、香料，以及具有更高价值的化妆产品。天然苯甲醇可以由多种植物合成，尤其在水果和茶叶中含量较多。然而，即使在这些含量较高的植物中，天然苯甲醇的含量也少于30mg/kg，这使得从植物中提取天然苯甲醇的成本非常高。目前市面上售卖的苯甲醇通常是从石油等化石燃料中提炼得到的，并不能称之为天然苯甲醇。并且该过程消耗了大量的不可再生资源，造成了能源的浪费和环境的污染；2-苯乙醇(2-PE)在鲜花的花瓣和水果中含量较高，具有类似于玫瑰的香味。因为其优良的香味特性常常被用于改变或增强产品的整体风味，例如2-PE可以用来合成在食品和化妆品中常用来增香的芳香酯——丙酸苯乙酯。目前全球2-PE年产量已经超过10000t，而其中大部分是以苯或苯乙烯为原料通过化学的方式合成，价格约为5美元/kg。与化学生产苯甲醇方式类似，该过程不仅会涉及高温、高压等高耗量反应，而且最终的产物中会夹杂大量且较难分离的副产物，给后期产品的纯化过程带来极大困难，从而降低了合成效率并且增加了生产成本；尿黑酸(2,5-二羟基苯乙酸)是一种酚酸，存在于草莓树蜜中。由尿黑酸衍生的一些产物具有较大的价值。其中一个高价值的衍生物是可溶性的黑色素，它广泛的存在于自然界中，通常是由多羟基的酚类化合物氧化并聚合而成。这种黑色素可以通过吸收紫外线、γ射线，以及清除氧自由基的方式保护细胞，是生产药物和化妆品的原料之一；酪醇是一种具有重要工业和医药价值的芳香醇。酪醇是众多有价值化合物的重要前体。例如，可以利用酪醇合成具有苦味的添加剂改善清酒的风味，还可以用来合成重要的抗氧化剂——羟基酪醇，该化合物可以用于预防心血管疾病和骨质疏松。酪醇最早是在橄榄油和葡萄糖酒中被发现的一种天然芳香醇，由于通过分离提取的方式生产酪醇的成本极高，目前主要以化学的方式合成。但是化学合成的过程复杂且产品收率较低，导致酪醇的价格一直居高不下。因此有必要开发高效生物合成苯丙酮酸及4-羟基苯丙酮酸衍生物的方法，以减少该类物质对化学合成的依赖。

本发明的主要目的在于实现高效生物合成苯丙酮酸及4-羟基苯丙酮酸的衍生物。以苯甲醇为例对大肠杆菌进行逐步改造以积累苯丙酮酸和4-羟基苯丙酮酸，然后将苯乙醇、尿黑酸和酪醇的生物合成途径导入改造后的宿主体内实现多种苯丙酮酸及4-羟基苯丙酮酸衍生物的高效生物合成。实验结果表明，经过本方法改造后的工程宿主菌利用葡萄糖在摇瓶中可以生产492mg/L苯甲醇，662mg/L苯乙醇，1.1g/L尿黑酸和2.5g/L酪醇。

发明内容